课程

生物化学与分子生物学实验

题目

蛋白质的理化性质及其含量测定

学时

讲授

实验

练习

行课时间

课次

教 材

《生物化学与分子生物实验学》，科学出版社出版，宋海星主编，2012年

教 具

多媒体课件

教 学

目 的

要 求

掌握氨基酸等电点测定和计算方法，五种常见的蛋白质含量测定方法的基本原理。

熟悉蛋白质的氨基酸组成与紫外吸收的关系，蛋白质胶体溶液的稳定因素。

了解蛋白质一级结构的测定方法。

教学重点

难点及其

解决方案

教学重点: 蛋白质的两性解离和等电点，蛋白质含量的经典测定方法

解决方案：讲清楚基本概念，注意归纳要点。

教学难点: 蛋白质的性质与含量测定之间的关系

解决方案：讲清楚基本概念，注意归纳要点。

参 考

资 料

1. 王镜岩主编，生物化学（第三版），高等教育出版社，2004年

2. 孙培龙、吴石金 主编，生物化学技术实验指导，化学工业出版社，2008年

3. 高继国、郭春绒 主编，普通生物化学教程实验指导，化学工业出版社，2009年

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

一、氨基酸的性质（25 min）

1．酸碱性质和等电点：氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基，在水溶液中以偶极离子的形式存在，所以氨基酸是两性电解质。在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。氨基酸等电点由氨基、羧基和侧链基团的解离状态共同决定的。

2. 光学活性和光谱性质：除甘氨酸外，所有天然α-氨基酸都有不对称碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸由于含有共轭双键，在280nm附近有最大吸收峰。由于大多数蛋白质含有酪氨酸和色氨酸残基，所以测定蛋白质280nm的光吸收值，是定量分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。

3. 重要化学反应：与2，4---二硝基氟苯（DNFB）的反应(Sanger反应)、与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）、与茚三酮的反应、成肽反应

二、蛋白质的重要性质（40 min）

1. 两性解离性质及等电点：蛋白质分子中仍然存在游离的氨基和游离的羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质。蛋白质分子所带正、负电荷相等时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。

2. 蛋白质的胶体性质：蛋白质具有亲水溶胶的性质。蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素。

3. 蛋白质的沉淀：加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层，蛋白质胶体溶液不再稳定而从溶液中析出的现象。沉淀的方法有：加入高浓度的中性盐、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂和加热等。

4. 蛋白质的变性与复性：在某些理化因素作用下，蛋白质的空间结构被破坏，从而导致其理化性质改变、生物活性丧失的现象称为变性；蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性。

PPT

详细讲解氨基酸等电点的测定方法

举例：蛋白质溶液的稳定性

提问：蛋白质溶液最佳存放温度为多少？

举例：消毒与灭菌

提问：为什么消毒时用75%的酒精，而不用更高浓度的酒精？

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

5. 蛋白质的紫外吸收特性：蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基对紫外光有吸收，以色氨酸吸收最强，最大吸收峰为280nm。

6. 蛋白质的呈色反应：蛋白质分子中的肽键和许多侧链基团均可与一些特定的试剂发生呈色反应。这些呈色反应常用于蛋白质的定性和定量。

三、蛋白质的含量测定（40 min）

1. 凯式定氮法（Kjedahl法）：将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定。常用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰物（非蛋白氮）少，但费时较长。

2. 双缩脲法（Biuret法）：在碱性条件下，多肽键与Cu+形成紫色络合物，在540nm处有最大吸收，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。用于快速测定，但灵敏度低。  

3. 紫外吸收法：蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处有最大光吸收。常用于层析柱流出液的检测，对于核酸的干扰可进行适当校正。

4. Folin-酚试剂法：在双缩脲反应的基础上，磷钼酸-磷钨酸试剂被酪氨酸和苯丙氨酸还原成深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物。在一定条件下，蓝色的深浅与蛋白质的量成正比。此法灵敏度较高，是应用较广泛的蛋白定量方法之一。

5. 考马斯亮蓝法：考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质的浓度成正比。此法是测定蛋白质的较好方法，干扰物质少，颜色稳定。

四、蛋白质一级结构测定（10 min）

1. 基本策略：

  片段重叠法＋氨基酸顺序直测法 

2. 基本步骤：

(1) 测定蛋白质分子中多肽链数目；

(2) 拆分蛋白质的多肽链，断开多肽链内二硫键；

PPT

对比不同含量测定方法的灵敏度、适用范围

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

(3) 分析每一条多肽链的氨基酸组成； 

(4) 鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基； 

(5) 裂解多肽链成较小的片段； 

(6) 测定各肽段的氨基酸顺序；

(7) 片段重叠法重建完整多肽链一级结构； 

(8) 确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。

五、小结（5 min）

 几种蛋白质含量测定方法的优缺点

布置思考题