课程

医学生物实验学

题目

细胞融合

学时

讲授

实验

3

练习

行课时间

2015年06 月 11日第1-3节

课次

第 5次

教 材

潘克俭.医学生物实验学.北京：科学出版社,2012

教 具

教学PPT、教学视频

教 学

目 的

要 求

1、掌握动物细胞融合原理。

2、熟悉鸡血细胞融合技术方法。

3、了解细胞融合的应用前景。

教学重点

难点及其

解决方案

重点：细胞活力计算方法

难点：细胞融合原理

解决方案：动画演示、对比、总结

参 考

资 料

杨抚华.医学生物学（第七版）.北京：科学出版社,2011

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

【讲解】（40min）

细胞融合：两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。

同种细胞融合、种间细胞融合、动植物细胞间融合。

动物细胞：仙台病毒法、PEG法、电融合法。

植物细胞： PEG法、电融合法。

微生物细胞： PEG法。

1、仙台病毒法

2．PEG 诱导融合法

3．电融合法

实验内容：鸡血细胞融合

（一） 50% PEG液的制备

称取一定量的PEG（MV=4000）放入刻度离心管内，在酒精灯火焰上加热，使其熔化，待冷至50℃时，加入等体积并预热的0.75%生理盐水混匀，置之37℃水浴箱中保温待用。

（二）鸡血细胞制备

取肝素抗凝鸡血1ml，加4ml生理盐水保存备用。

（三）细胞融合操作：

1、取肝素抗凝的弃血清鸡血0.4ml,加入8ml生理盐水.   将悬液移入离心管中， 3000转/分离心8min，倾去上清液，加入8ml生理盐水,再次悬浮细胞，离心洗涤一次，倾去上清液后将离心管倒置于滤纸上，尽量流尽剩余液体（这一步很重要，因为残留液体会改变PEG的浓度）。

2．用手指轻弹离心管底壁，使沉淀物松散。吸取制备好的50%PEG 0.1 ml，在37℃水浴中，于90s内逐滴加入离心管中，边加边振摇离心管，使之与细胞混匀，然后加入8ml生理盐水，轻轻吸打混匀，在37℃水浴中静置5min以稀释PEG。3000rpm离心8min弃去上清液后，加入2ml生理盐水，在37℃水浴中温育30min。

3、 融合过程观察：分别于温育5、10、20、30分钟，取细胞悬液一滴制成临时装片，以0.2%次甲基蓝一滴染液染色，在显微镜下观察细胞融合的不同阶段。通常可把融合过程分为五个阶段：

1）两个细胞的细胞膜之间相互接触、粘连。

2）相接触的两细胞膜破口粘合，形成细胞膜通道。

3）两细胞之间细胞质相通，形成细胞质通道。

4）通道扩大，两细胞连成一体。

5）细胞合并完成，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。

上述阶段可在不同时间的临时装片上观察到。

5. 融合率的计算：对孵育30min时制备的临时装片计算融合率。融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞，其细胞核的总数与此视野内所有细胞（包括已融合细胞和未融合细胞）的细胞核总数之比。融合率通常以百分数来表示，而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为准确。

（三）注意事项

1、制备的50%PEG一定要保温在于37℃水浴中，不论冷却后结晶析出。

2、在离心管中加PEG之前，一定要将离心管倒置滤纸上，流尽剩余液体，否则残留液会改变PEG的浓度。

【布置作业】（1min）

（一）写实验报告，计算细胞活力及融合率。

（二）思考题题

1、 检测细胞活力的方法有哪些？

2、 细胞融合的方法有哪些？

【辅导学生实验】（77min）

【总结实验】（2min）

板书提纲  

实验五  细胞融合                                                                          

细胞融合方式：

1、仙台病毒法

2．PEG 诱导融合法

3．电融合法

实验内容：鸡血细胞融合

通过提问引起思考，引入新课：如何在显微镜下区别死细胞与活细胞？

图示、对比

举例、图示

问答

问题、总结

概括、简略讲述

大标题保留至课终以便小结时用

次级标题、重要概念、要点保留至一个大问题讲完后擦掉