课程

分子生物学实验

题目

重组载体鉴定

学时

讲授

实验

3

练习

行课时间

2015年6月9日 星期二8:00-10:20

课次

第8次

教 材

生物化学与分子生物学实验，科学出版社，杨建雄

教 具

ppt

教 学

目 的

要 求

 掌握重组载体PCR、限制性酶切鉴定的原理和主要方法

熟悉重组载体PCR、限制性酶切鉴定的主要步骤

了解重组载体鉴定的几种方法

教学重点

难点及其

解决方案

教学重点: 重组载体鉴定的原理和方法

教学难点: 重组载体鉴定的原理

解决方案：基本操作技术通过采取面对面，一对一的形式进行教学指导，鼓励学生反复训练

参 考

资 料

1. 魏群 主编，分子生物学实验指导，高等教育出版社，2010年

2. 郑伟娟 主编，现代分子生物学实验，高等教育出版社，2008年

3、李钧敏 主编，分子生物学实验，浙江大学出版社，2009年

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

【实验原理】

重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导致。

重组子鉴定的常用办法：

（一）插入失活法

外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法（白色菌落是重组质粒）。

（二）PCR筛选和限制酶酶切法

提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。

（三）核酸分子杂交法

制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。

（四）免疫学筛选法

获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。

上述方法获得的阳性克隆最后要进行测序分析，以最终确认目的基因。

【器材与试剂】

1. 37℃摇床，移液枪，超净台，离心机

  2. LB培养基，卡纳抗生素，BamHI酶及其酶切缓冲液; XhoI酶及其酶切缓冲液;琼脂糖(Agarose)，5×TBE电泳缓冲液：6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝。

实验原理介绍

20min

讲授10 min

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

【实验方法与步骤】 

1、从培养过夜的琼脂平板上挑选长势良好的克隆到3ml的LB液体培养基中，含卡纳抗生素50μg/ml, 37℃摇床震荡12-16h。

2、取1.5ml培养物入微量离心管中，提取质粒，核酸分析仪检测质粒浓度。

3、采用BamH、Xho1双酶切，37℃ 酶切1-3h。

4、配制1%的琼脂糖凝胶电泳，检测酶切产物。

5、若可以观察到目的片段，重组载体进行序列测定。

实验操作

小结

重组载体双酶切鉴定的原理和方法

简要板书

1. 重组载体鉴定的几种方法

2. 重组载体鉴定的注意事项

步骤重点介绍

 20min

操作

60min

小结

10min