课程

分子生物学

实验技术

题目

质粒的酶切和连接

学时

讲授

实验

3

练习

行课时间

2015年5月19日 8:00-10:20

课次

第5次

教 材

生物化学与分子生物学实验，科学出版社，杨建雄

教 具

ppt

教 学

目 的

要 求

1、掌握限制性内切酶、连接酶原理

2、熟悉相关酶切、连接实验操作

3、了解各种内切酶的作用位点和连接酶的连接效率

教学重点

难点及其

解决方案

教学重点: 限制性内切酶、连接酶原理

教学难点: 相关酶切实验操作

解决方案：通过Flash演示酶切和连接反应过程

参 考

资 料

1. 魏群 主编，分子生物学实验指导，高等教育出版社，2010年

2. 郑伟娟 主编，现代分子生物学实验，高等教育出版社，2008年

3. 李钧敏 主编，分子生物学实验，浙江大学出版社，2009年

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

【双酶切及DNA连接酶原理】

限制性内切酶定义：DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。

限制性内切酶分类：分为三类:Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类。Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列,有少数酶识别更长的序列或简并序列。

限制性内切酶特点：Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5'…G↓AATTC…3' 

3'…CTTAA↑G …5' 

影响限制性内切酶的因素：DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 

DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。

DNA连接酶（ligase）定义：又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP)的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等。

【实验过程】：

实验材料：λDNA; 重组pGEX-6p-1质粒; BamHI酶及其酶切缓冲液; XhoI酶及其酶切缓冲液;琼脂糖(Agarose)、T4 DNA连接酶及T4DNA连接酶 buffer。 

【实验试剂】：

5×TBE电泳缓冲液：6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。

【实验步骤】：

1、DNA酶切反应

1) 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl。

讲授5min

重点介绍

30min

重点讲授

讲授10min

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

2) 将管内溶液混匀后各加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。,要防止错加，漏加。

3) 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。 

4) 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。

2、 DNA分子量标准的制备 

采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子。

3、DNA连接反应

按照酶切后质粒和片段1:3的比例加入连接体系中，20μl体系加入酶切后的质粒2μl，片段6μl，连接酶2μl，连接酶buffer 2μl，无菌水8μl。

混匀后16℃连接4h或者4℃过夜，-20℃保存。

【限制性内切酶酶切注意事项】

1. 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。

2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活。

3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应。

4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。

5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。

【限制性内切酶酶切注意事项】

1)10xLigation Buffer含有ATP，使用前应在室温放置至融化或用手掌温度辅助融化，然后置于冰上。不要加热融化以免ATP降解。

2)T4 DNA Ligase对热敏感，容易失活。使用时请放置冰上，用后立即置冰箱中冷冻保存。

3)如需在接反应后灭活T4 DNA Ligase，可于65℃孵育10min即可。

实验操作   小结

简要板书

1. 酶切反应的特点

2. 酶切反应的主要步骤和注意事项

实验操作60min

提出问题学生解答

10min

5min