细胞生物学实验技术教学大纲
Experiment technique of Cell Biology
（供四年制生物技术专业使用）
前 言
细胞生物学实验技术是配合细胞生物学的理论教学而开设的一门实验技术课程，是生物技术专业的专业基础课程。
开设本课程的目的是使学生在学习细胞生物学理论知识的同时，从观察细胞开始，逐步掌握细胞生物学的基本实验原理、基本方法与技术和相关仪器设备的操作方法，巩固和加深理论知识的理解，提高学生的动手能力及发现问题、分析问题、解决问题的能力，为后期分子生物学、细胞工程、免疫学等课程及从事细胞生物学相关科学研究工作奠定坚实的技术操作基础。
本课程需要细胞生物学理论知识作基础。
本大纲与自编讲义《医学生物学与细胞生物学实验指导》配套使用，适用于四年制生物技术专业本科生的教学。大纲所列教学内容通过实验方式进行教学。划横线部分为要求学生重点掌握的内容，其他为熟悉和了解内容，总学时为45学时。
本课程为校考课程，课程考核组成为平时成绩30％，实验成绩30％，课终考核成绩40％。平时考成绩以实验报告为主，还包括出勤率、课堂表现等；实验成绩为实验操作考试成绩，课终考核为闭卷笔答考试。
参考学时分配
| 内容
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理论学时数
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实验学时数
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| 细胞的形态结构和显微测量
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3
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| 光镜下的细胞器和细胞有丝分裂
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3
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| 细胞骨架的观察
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3
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| 细胞吞噬活动的观察
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3
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| 细胞核与线粒体的分级分离
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3
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| 叶绿体的分离与荧光观察
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3
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| 细胞培养器械、用液的配制和消毒
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6
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| 细胞的原代培养
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6
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| 细胞株的培养、传代及冻存复苏
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6
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| 培养细胞的活力测定
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3
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| 细胞融合
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3
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| 细胞凋亡诱导及形态学特征观察
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3
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| 合计
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45学时
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细胞的形态结构和显微测量
目的要求
掌握光学显微镜下真核细胞的基本形态结构，临时装片的制作，细胞的显微测量方法。
熟悉光学显微镜的使用，生物绘图的方法。
了解观察的标本细胞的基本形态结构和大小。
教学内容
1、根据情况自制人口腔黏膜上皮细胞、蟾蜍及人血细胞涂片等临时装片。
2、观察各种动植物切片或临时装片，如玉葱鳞叶、人口腔粘膜上皮细胞、、家兔骨骼肌纵切片、黑斑蛙透明软骨切片、蟾蜍及人血细胞涂片等，掌握其细胞的基本形态以及动植物细胞的区别。
3、显微测量 测微尺的种类、目镜测微尺和镜台测微尺的用途、测微尺测量的步骤以及计算公式。图像分析系统进行显微测量的步骤及优点。
4、对标本细胞进行显微测量，并计算至少一种细胞的长径和短径平均值。
5、学习生物绘图的基本要点 点、线的结合，图标的要求，图名的要求。
光镜下的细胞器和细胞有丝分裂
目的要求
掌握光镜下可见的细胞器的形态，植物细胞有丝分裂各期的形态特征，动植物细胞有丝分裂过程中形态学的区别。
熟悉临时装片的制作。
了解细胞器在细胞中的作用。
教学内容
1、制作新鲜黑藻叶的临时装片。
2、叶绿体的观察 观察叶绿体、细胞核的形态、数目和分布情况。叶绿体的运动方式。
3、高尔基复合体的观察 用家兔脊神经节的切片，观察高尔基复合体的形态结构。
4、中心体的观察 用马蛔虫有丝分裂切片，观察中心体的形态结构和分布情况。
5、总结在光镜下能观察到的细胞器以及这些细胞器的功能。
6、观察洋葱根尖有丝分裂前期、中期、后期和末期细胞，掌握各自特点。
7、观察马蛔虫受精卵细胞有丝分裂切片，对比总结动植物细胞有丝分裂过程中形态学的区别。
细胞骨架的观察
目的要求
掌握光镜下细胞骨架显示的方法，各种主要试剂的作用。
熟悉细胞骨架显示的原理。
了解细胞骨架在细胞中的作用。
教学内容
1、细胞骨架在光镜下显示的原理 当用适当浓度的TritonX-100处理细胞后，可破坏细胞膜和细胞内的蛋白质，但细胞骨架系统的蛋白质却保护完好，经戊二醛固定，蛋白质的特异性染料考马斯亮蓝R250染色后，用光学显微镜观察，可以见到细胞内一种以微丝为主的网状结构，即是细胞骨架。
2、制作细胞的微丝标本 选取洋葱鳞叶内表皮细胞，制作临时装片，并按照实验步骤处理细胞标本，对细胞骨架进行特异性染色。掌握各种主要试剂在处理标本时的作用。
3、观察细胞骨架标本，了解其存在状态、结构和分布。
4、总结实验成败的关键，并拓展其他显示细胞骨架的方法。
细胞吞噬活动的观察
目的要求
掌握巨噬细胞的吞噬活动过程。
熟悉细胞吞噬活动的诱发机理。
了解细胞吞噬活动与溶酶体的关系。
教学内容
1、巨噬细胞的诱生 实验前三天，每天向小鼠腹腔注射淀粉肉汤，刺激巨噬细胞大量产生。
2、实验当天向小鼠腹腔注射1％鸡红细胞悬液，30分钟后处死小鼠，取腹腔液。
3、制作临时装片，观察巨噬细胞对红细胞的吞噬活动过程。
细胞核与线粒体的分级分离
目的要求
掌握细胞器的分级分离的原理和步骤。
熟悉细胞核的分离和分析方法。
了解线粒体的分离和分析方法。
教学内容
1、分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分离纯化和细胞器的分析三步。
2、分离纯化的方法主要是离心，其中离心又可分为：差速离心和密度梯度离心两种。本实验采用差速离心法。差速离心根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别，分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方法。从低速到高速逐级沉淀分离。
3、小鼠肝脏组织细胞匀浆的制备。
3、细胞核的分离和分析 低速离心分离，甲苯胺蓝染色分析。
4、线粒体的分离和分析 高速离心分离，詹纳斯绿b染色分析，油镜观察。
叶绿体的分离和荧光观察
目的要求
掌握植物细胞叶绿体的分离原理和方法。
熟悉荧光显微镜的使用方法。
了解叶绿体的自发荧光和次生荧光。
教学内容
1、叶绿体的分离原理 叶绿体的分离与细胞器的分离原理相同，其过程包括组织细胞匀浆、分离纯化和细胞器的分析三步。其中分级分离可采用差速离心或密度梯度离心进行。本实验两种方法均可。差速离心的原理同《细胞核与线粒体的分级分离》；密度梯度离心是利用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。
2、叶绿体的分离 材料的破碎，叶绿体的差速离心分离或密度梯度离心分离。
3、氯化钠溶液悬浮，普通光学显微镜观察。
4、叶片手工切片和普通光学显微镜观察。
5、荧光显微镜观察叶绿体自发荧光。
6、荧光染料染色后，叶绿体次生荧光的观察。
细胞培养器械、用液的配制和消毒
目的要求
掌握细胞培养无菌间的基本要求，各种相关设备的使用方法，培养器械清洗和消毒，用液灭菌的方法。
熟悉细胞培养用液的配制方法，血清的灭活方法，各种用液的分装和保存原则。
了解细胞培养准备阶段的重要性。
教学内容
1、细胞培养无菌间 无菌间的环境要求、设备仪器放置要求、消毒要求、人员进出的要求。
2、细胞培养所需的各种仪器设备 超净工作台、CO2培养箱、液氮罐、离心机、倒置相差显微镜等仪器设备的使用方法和注意事项。
3、细胞培养器械的种类 玻璃器皿、金属器皿、橡胶器皿、塑料器皿的用途。
4、培养用具的清洗 玻璃器皿的清洗、塑料器皿的清洗、金属器皿的清洗、橡胶用品的清洗。
5、培养用液的配制 培养液、消化液、缓冲液、补充液的配制；抗生素备用液的配制和补充；血清的灭活和分装。
6、培养用品的灭菌 根据不同的材质和要求选择不同的灭菌方法：高压湿热灭菌、过滤除菌、紫外灭菌、高热灭菌。
7、培养用品的分装和保存 分装的原则；保存的方式和温度。
细胞原代培养
目的要求
掌握无菌操作的关键、细胞培养的原理，掌握酶消化法培养细胞的全过程，细胞计数。
熟悉组织块原代培养法。
了解各种试剂在细胞培养中的作用。
教学内容
1、细胞培养基础知识介绍 细胞培养定义、分类、方法。细胞培养的关键——无菌操作。细胞原代培养的基本步骤。
2、培养间的消毒灭菌 紫外消毒、超净工作台的使用和准备。
3、实验操作者的准备 消毒衣的准备，帽子、口罩等准备，双手的消毒灭菌。
4、组织块法 取新生乳鼠或其他实验动物器官，清洗、剪块，装入培养瓶，反面加入培养液，静置培养，翻转继续培养。
5、酶消化法 取新生乳鼠或其他实验动物器官，胰酶消化成单细胞，消化程度的掌握，停止消化，收集细胞，细胞计数、细胞在CO2培养箱中培养。
6、培养细胞的观察 每隔一定时间观察培养中的细胞的生长状态，拍照并记录。
细胞株的培养、传代及冻存复苏
目的要求
掌握细胞传代概念，培养中细胞的Hayflick界限，细胞传代方法，细胞株复苏的操作过程，细胞冻存的原则。
熟悉培养细胞的生长曲线，细胞传代的最佳时间点。
了解细胞培养污染的类型和处理方法。
教学内容
1、细胞的传代、复苏、冻存的原则 细胞传代培养的定义，细胞的Hayflick界限；细胞复苏：快速解冻；细胞冻存：逐步降温。
2、细胞传代培养的操作过程 培养的贴壁生长的细胞的观察，选择合适的传代时间。胰酶消化成单细胞，分瓶传代，培养2-3天后观察细胞状态。
3、传代细胞的生长曲线，下一次细胞传代的最佳时间点。
4、细胞的复苏 从液氮中快速取冻存的细胞，除去冻存液，离心稀释培养。
5、细胞的冻存 观察培养的细胞，选择生长状态良好的细胞，收集细胞，逐步降温，冻存在液氮中。
培养细胞的活力测定
目的要求
掌握细胞活力检测的方法之一，血球计数板的计算方法。
熟悉检测细胞死活的方法种类。
了解检测细胞死活方法的原理。
教学内容
1、培养中细胞活力检测的方法和用途 染色计数法、比色法、克隆形成法、仪器分析法；用于药物筛选、细胞药敏实验、细胞抑制率检测等方面。
2、化学染色法测细胞活力的种类、用途和方法 死细胞着色法：台盼蓝法、苯胺黑法、赤显红法等。活细胞着色法：甲苯胺蓝法或亚甲基蓝法。方法：悬液与染料混合均匀后，滴加在血球计数板上，计数，计算细胞活力。
3、比色法检测细胞活力 MTT法的原理、细胞培养板的使用、酶标仪的使用和操作的注意事项；
4、MTT操作过程 在96孔板中培养细胞，分组处理细胞，培养一定时间后MTT染色，酶标仪检测OD值，数据分析。
5、以上方法根据实验条件至少选择一种方法进行实验。
细胞融合
目的要求
掌握细胞融合的概念和各种方法，PEG介导细胞融合的关键。
熟悉细胞融合的原理。
了解其他细胞融合的方法。
教学内容
1、细胞融合 细胞融合的定义和原理。PEG介导细胞融合的过程和关键。其他细胞融合的方法。
2、PEG介导细胞融合 取培养中的细胞或稀释的鸡血细胞制备成细胞悬液，缓冲液冲洗干净后离心，完全弃去上清液，弹松沉淀，逐滴滴加PEG，加入培养基培养后，分别与5、10、20、30分钟取细胞悬液制成临时装片。
3、观察细胞融合过程。
4、计算一定时间内细胞融合率。
细胞凋亡诱导及形态学特征观察
教学目的与要求
掌握细胞凋亡的形态学检测方法。
熟悉细胞凋亡的药物诱导方法。
了解其他检测细胞凋亡的方法。
教学内容
1、细胞凋亡的形态学特征 细胞缩小、核膜皱褶、染色质浓缩且边缘化，质膜出泡形成凋亡小体。
2、细胞凋亡的检测方法：形态学方法（光学显微镜检测、荧光显微镜检测）、DNA ladder、TUNEL法、流式细胞仪检测等。
3、细胞凋亡的诱导 培养细胞，待生长到对数生长期，用凋亡诱导药物处理。
4、去除药物，收集细胞。
5、细胞凋亡形态学特征的观察 至少选择一种方法进行检测。普通光学显微镜检测：甲基绿—派诺宁染色等。荧光显微镜检测 Hoeschst染色、AO-EB染色等。
6、观察凋亡细胞的形态学特征。
7、细胞凋亡检测的意义 药物筛选、药敏实验、肿瘤机制研究等。
附：
常用英文词汇表
| 光学显微镜
|
light microscope
|
倒置显微镜
|
inverted microscope
|
| 荧光显微镜
|
fluorescence microscope
|
相差显微镜
|
phase contrast microscope
|
| 叶绿体
|
chloroplast
|
高尔基复合体
|
Golgi complex
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| 中心体
|
centrosome
|
线粒体
|
mitochondria
|
| 细胞骨架
|
cytoskeletons
|
微丝
|
microfilament
|
| 吞噬作用
|
phagocytosis
|
有丝分裂
|
mitosis
|
| 有丝分裂器
|
mitosis apparatus
|
间期
|
interphase
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| 前期
|
prophase
|
染色丝
|
chromonema
|
| 中期
|
metaphase
|
赤道板
|
equatorial plate
|
| 染色单体
|
chromatid
|
后期
|
anaphase
|
| 末期
|
telophase
|
细胞培养
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cell culture
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| 原代培养
|
primary culture
|
传代培养
|
sub-culture
|
| 冻存
|
cryopreservation
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复苏
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cell thawing
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| 细胞融合
|
cell fusion
|
细胞凋亡
|
apoptosis
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