| 细胞原代培养（1）
一、细胞培养的基本概念和分类 （15′）
（一）概念
指的是从体内取出组织，在模拟体内生理环境(无菌、适当温度和一定营养条件)，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。特点是细胞不从组织中失散，保持与组织原来的关系。
（二）分类
培养物是单个细胞和细胞群。特点组织失散，只有细胞和派生细胞的关系。细胞培养和组织培养不是绝对的分开，有交叉。
1、原代培养——直接从动植物取材，在体外进行培养。
2、传代培养——培养中的细胞进行分瓶，以1:2或1:3等比例分装到新的培养器皿中进行培养的过程。
二、细胞原代培养的基本技术和步骤 （40′）
（一）概念
1、由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。
2、幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养
（二）分类
1、组织块培养法：是将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长
2、消化培养法：用酶将组织消化成单细胞，一定密度接种
（三）具体的操作步骤
1、取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
2、切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清（或离心，800－1000转／分，5分钟）
3、组织块培养法：
用吸管吸取小块，在培养瓶底部均匀摆开，翻转培养瓶，加入2－3ml培养液，培养4－5h后，待组织卡能牢固贴于瓶壁，再轻轻翻转培养瓶，静置培养。3天后观察，在组织块边缘是否有细胞长出，根据培养液颜色，适当补充或更换培养液，10－15d可长成单层，此时，可传代培养。
4、消化法：
加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），组织块变松散，颜色略白时，拿出反复吹打，加入培养液终止消化。过滤。离心，吸去上清，（可反复一次），沉淀加入3－5～10ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，计数，细胞浓度为5×105, 移入培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
5、血球计数板的使用
（1）血球计数板的结构
（2）原则：计左不计右，计上不计下，防止重复计数。
（3）公式：
（细胞悬液的细胞数）/ml＝ （ 四个大格子细胞数/4) ×稀释倍数×104
三、细胞原代培养教学视频 （40′）
四、各组讨论：细胞原代培养方案 （25′）
板书设计：
细胞的原代培养（1）
一、 原代培养
二、 分类：组织块培养法、酶消化法
三、 组织块培养法
四、 酶消化法
关键：无菌技术
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