| 叶绿体的分离和荧光观察
一、理论讲述： （20′）
叶绿体的密度梯度离心分离
用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。
目前有多种梯度介质成功地用于细胞的分离，如蔗糖、氯化铯。蔗糖是最常用的介质材料，梯度范围可以从5％－20％至10％－60％。
这类分离又可分为速率-区带梯度离心和等密度梯度离心两种。
优点是一次离心可分离提纯样品中几种组份，用于较精细的分离。
二、实验操作 （80′）
（一）叶绿体的分离与观察
1．洗净菠菜叶，去叶柄、主脉后，称取2-3 g，剪碎。
2．加入预冷到近0℃的匀浆介质（(0.25 mol／L蔗糖，0.05mol／L Tris-HCI缓冲液，pH7.4)）10mL，在组织捣碎器上选高速挡捣碎2 分钟或冰上用研钵研磨。
3．捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。
4．将滤液移入2mL离心管，500r／min离心10min，轻轻吸取上清液。
5．在1.5 mL离心管内依次加入50％蔗糖溶液和15％蔗糖溶液各0.4mL，注意15％蔗糖溶液沿离心管踏缓缓注入，不能搅动50％蔗糖液面。密度梯度制好后可见两种溶液界面处折光有所不同。
6．小心地沿离心管壁加入0.4mL上清液。
7．用水平转头离心8 000r／min，20min。
8．取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带。
9．用滴管轻轻吸出—滴叶绿体滴于载玻片上，盖上盖玻片。
10.(1)在普通光镜下观察。
(2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。
（3）在荧光显微镜下观察叶绿休的间接荧光
取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载玻片上，再滴加一滴0.01％吖啶橙荧光染料，加盖玻片后即可在荧光显微镜下观察。
（二）菠菜叶手切片观察
1、新鲜菠菜叶——刀片切出一斜面置于载玻片上——滴加1~2d氯化钠溶液——盖上盖片显微镜下观察
2、荧光显微镜观察：吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光, 气孔仍为绿色。
小结 （20′）
1、荧光显微镜观察标本的注意事项
2、叶绿体分离的方法除了密度梯度离心还能用什么方法？
3、为什么叶绿体可以在荧光显微镜下观察？吖啶橙在其中起什么作用？
板书设计：
叶绿体的分离和荧光观察
一、 细胞器分离：破碎——分离纯化——鉴定
二、 密度梯度离心
三、 叶绿体的分离
1、 破碎
2、 密度梯度离心
3、 荧光染色
4、 叶片徒手切片对照
四、 荧光显微镜观察
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