| 细胞核与线粒体的分级分离
一、理论讲述： （20′）
1、细胞器分离的基本思路：
破碎细胞——分离纯化——细胞器鉴定
2、细胞破碎
破碎细胞需要在合适的匀浆介质中，采用比较温和的程序以保持目的细胞器的结构完整和生化活性。
常用的细胞破碎方法包括渗透压冲击、超声波振荡、玻璃珠研磨、剪切等，有时甚至几种方法结合使用。
常用的细胞匀浆介质是等渗蔗糖溶液（0.25mol/L；约9％w/v，密度为1.03g/ml），其中补充了单价或二价阳离子、蛋白酶抑制剂和螯合剂等。匀浆物在低渗溶液中的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。
3、细胞器分离
根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术。
离心：差速离心、密度梯度离心
（1）差速离心指用大小不同的离心力使具有不同沉降系数的颗粒分批分离的方法，常用来分离各种细胞器及粗提核酸和蛋白质。例如被分离的物质是一种组织匀浆，可以根据各种细胞器的沉降系数大小，选择不同的离心速度和适当的时间，通过反复地悬浮和离心（2-3次），可以得到相当纯的细胞组分.
4、细胞器鉴定
包括光学显微镜、电子显微镜，或者检测合适的标志酶。在匀浆和纯化过程中跟踪合适的标志酶的活性可以使人确定目的细胞器的产率和污染其他细胞器成分的程度。
詹纳斯绿属于碱性染料，是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
二、实验操作 （90′）
（一）细胞核的分离提取
1、取猪肝一副，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％nacl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
2、将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／l蔗糖—Tris—Hcl溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。
3、剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。
4、将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；(3)余下的沉淀物进行下一步骤。
5、用6ml 0.25mol／l蔗糖—Tris—Hcl溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。
6、将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。
（二）高速离心分离提取线粒体
1、将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。
2、加入0.25mol／l蔗糖—Tris—Hcl lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.25mol／l蔗糖—Tris—Hcl溶液混匀成悬液(可用牙签)。
3、取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯绿b染液盖上盖片染20分钟。
4、油镜观察
小结 （10′）
1、显微镜下观察细胞核和线粒体的颜色和数目？
2、细胞器分级分离的原则？
3、线粒体还能用什么方法来鉴定？
习题
总结细胞器分级分离的原则和过程
板书设计：
细胞核与线粒体的分级分离
一、 细胞器分离：破碎——分离纯化——鉴定
二、 细胞破碎：方法；介质
三、 细胞器的分离：差速离心、密度梯度离心
四、 细胞器的鉴定
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