成 都 医 学 院 教 案 首 页
2014级 生物技术专业本科班 任课教师： 杨雨晗
| 课程
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细胞生物学实验技术
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题目
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细胞骨架的观察
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学时
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讲授
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0
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| 实验
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3
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| 练习
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0
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| 行课时间
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2015年4月 13日 第3节 至 第5节
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课次
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第 3次
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| 教 材
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《医学生物学与细胞生物学实验指导》
李虹，梁素华主编，科学出版社，2014.06 第二版
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| 教 具
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显微镜、玉葱鳞叶、载玻片、盖玻片等及教学多媒体
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| 教 学
目 的
要 求
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掌握: 细胞骨架显示的方法、各种主要试剂的作用。
熟悉: 细胞骨架显示的原理。
了解：细胞骨架在细胞中的作用。
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| 教学重点
难点及其
解决方案
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教学重点：细胞骨架显示方法的原理
教学难点：细胞骨架标本的制作
解决方案：通过讲述、演示实验、实验操作、对实验结果的分析来理解和掌握
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| 参 考
资 料
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《细胞生物学实验技术》 章静波等主编，化学工业出版社，第2版，2011
《医学细胞生物学》胡火珍等主编，科学出版社，第7版，2014
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| 实 施
情 况
小 结
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教研室主任签名： 201 年 月 日
成 都 医 学 院 教 案 续 页
| 教学过程、内容及时间分配
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教学方法与手段
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| 细胞骨架的观察
一、引题：提问： （10′）
1、细胞骨架（cytoskeleton）包括哪些成分？
2、你认为如何证明细胞骨架的存在？
3、能在显微镜下观察到细胞骨架吗？
二、理论讲述： （20′）
1、细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管（microtubule）、微丝（microfilament）和中间纤维或中间丝（intermediate filament）。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。
2、细胞骨架显示的一般原理：
（1）当用适当浓度的TritonX-100处理细胞后，可破坏细胞膜和细胞内的蛋白质，但细胞骨架系统的蛋白质却保护完好
（2）经戊二醛固定
（3）蛋白质的特异性染料考马斯亮蓝R250染色
（4）用光学显微镜观察，可以见到细胞内一种以微丝为主的网状结构，即是细胞骨架。
三、实验操作 （80′）
植物细胞的微丝观察
1．用镊子撕取洋葱鳞叶内表皮若干片约1cm2大小，放入小烧杯或小培养皿中，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.8）洗3次，每次约0.5 min。
2．吸去PBS，用1% TritonX-100，37℃处理洋葱表皮20min～30 min。
3. 除去TritonX-100，用M-缓冲液充分洗3次，每次约2 min，以使细胞骨架的稳定。
4. 加3.0% 戊二醛固定10 min。
5. 弃固定液，用PBS洗3次，每次约1 min，滤纸吸去残留液体。
6. 0.2%考马斯亮蓝R250染色10min～ 15 min。
7. 用清水冲洗数遍，降低背景。
8. 将样品置于载玻片上，加盖玻片，制成临时制片。
9. 在光学显微镜下观察。
小结和讨论 （10′）
1、细胞骨架的类型和功能
2、细胞骨架显示的原理
3、还有哪些方法能在显微镜下观察到细胞骨架？
板书设计：
细胞骨架的观察
一、 细胞骨架——微管、微丝、中间纤维
二、 细胞骨架显示：去除非骨架蛋白，固定并染色骨架蛋白
三、洋葱鳞叶内表皮细胞中细胞骨架的观察——微丝
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问答法
引导学生对理论知识的复习
讲授法
这里有一个Triton-X100处理等待时间，可由教师进行提问复习环节
操作法
实验指导
讨论结果在实验报告中，要注意引导学生利用荧光染色的方法特异性显示骨架
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