| 【课前复习】(1min)
首先评讲上节课的实验报告。点名表扬95分以上同学的实验报告，并挑选95分以上同学的实验报告作为示范，请全班同学观摩。
复习上次课PCR的相关实验，PCR-RFLP的原理、说明本节课的实验内容和要求。
【讲解】
【试剂与材料】（1min）
1、样本DNA、PRMT6上下游引物、Taq DNA聚合酶、10×PCR反应缓冲液、4×dNTPs、限制性内切酶TaqⅠ、10×酶切反应缓冲液、2.5%琼脂糖、1×TBE、6×上样缓冲液、DNA Marker。
2、微量加样器、PCR自动热循环仪。
二、PCR产物的限制性酶切 （10min）
20 ml酶切反应体系成分如下：
10×酶切反应缓冲液 2ul
PCR扩增产物 15ul
TaqaI内切酶（10 U/ml） 0.5ul
ddH2O 加至终体积 2.5 ul
置65℃水浴中消化2h。
三、琼脂糖凝胶电泳 （10min）
（1）称取2.5克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入100 ml 1×TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到2.5%琼脂糖凝胶液，待其冷却至60℃左右，加入2.5 μl 溴化乙啶贮存液（10 mg/ml），使溴化乙啶终浓度为0.5 μg/ml。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
（2）室温下静置30min左右，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。
（3）将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1 mm 深的足够电泳缓冲液，预电泳10 min。
（4）每份限制酶切产物取10 μl，加2 μl 6×上样缓冲液，混匀后加入到样品孔中，以100 V 电泳50分钟。
（5）断电后取出凝胶，放在紫外透射仪中观察并记录PCR—RFLP结果。
四、凝胶成像系统观察 （10min）
结果判断
观察并记录琼脂糖凝胶上的DNA带。 纯合子GG：酶切为307bp和66bp ；纯合子TT：不切，大小为373bp；杂合子GT：酶切为373bp、 307bp和66bp。
应用（5min）
DNA碱基突变、SNP多态的检测，遗传病的分子诊断，基因组遗传图的构建。
【注意事项】
1、根据碱基突变位点的分析，选择适当的限制性内切酶进行切割。
2、根据目的片段酶切后分子的大小来选择适当浓度的琼脂糖，以达到最佳分离效果。
【布置作业】（1min）
判断基因型、书写实验报告、讨论PCR-RFLP的意义
【辅导学生实验】（80min）：
教师巡回指导学生。
【总结实验】（2min）
板书提纲
一、PCR反应
二、PCR产物的限制性酶切
三、琼脂糖凝胶电泳
四、凝胶成像系统观察
|
