| 【课前复习】(1min)
首先评讲上节课的实验报告。点名表扬95分以上同学的实验报告，并挑选95分以上同学的实验报告作为示范，请全班同学观摩。
【新课引入】(1min)
因DNA链内发生的点突变及片段缺失、重复、插入等变异，其结果是即使其内切酶位点碱基序列没有变化，但原有的内切酶位点相对位置发生变化从而导致RFLP。本次课将以蛋白质精氨酸甲基转移酶-6（PRMT6）rs12097821 SNP位点作为PCR扩增的对象，通过限制酶TaqaⅠ切割位点的有无，来区别野生型与突变型样本。
【讲解】（10min）
【实验原理】
聚合酶链式反应（PCR）是模拟体内DNA复制条件在体外酶促合成特异DNA片段的循环反应，可使目的DNA片段得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置于高温（约93℃~95℃）下使之变性解链；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温（约50℃~70℃）下分别与目的DNA片段两侧的互补序列复性结合；引物在DNA聚合酶作用（约70℃~75℃）下沿模板按5’→3’方向延伸，合成目的DNA片段的新互补链。如此经过n个周期，理论上扩增2n倍，一般PCR经30~40周期后可获得百万倍以上的目的DNA。
聚合酶链式反应-限制酶片段长度多态（PCR-RFLP）分析技术是在PCR技术基础上发展起来的。如果DNA的突变位点发生在某种限制性内切酶的识别位点上，这段DNA就会增加或丢失该限制性酶的酶切点。利用这种限制性酶切割这段DNA的PCR产物，野生型和突变体样本会产生长短不同的酶切产物，可以利用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳加以区分。
本实验选用人的蛋白质精氨酸甲基转移酶-6（PRMT6）作为PCR扩增的对象，以扩增产物中rs12097821 SNP位点[G/T]，通过限制酶TaqaⅠ切割位点的有无来区别野生型与突变型样本。本实验的引物序列：F5'CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACACAATATTTATGCTA
ATTGTCTTATTTTTACAAATGTAAATC 3'；R5' ATGTGTCTGGTGCTTGAGGT 3'；
PCR产物的长度为373bp； 酶TaqaI 酶切位点：TCGA，GG：酶切为307bp和66bp ；TT：不切，大小为373bp；GT：酶切为373bp、 307bp和66bp。
【试剂与材料】（5min）
1、样本DNA、PRMT6上下游引物、Taq DNA聚合酶、10×PCR反应缓冲液、4×dNTPs、限制性内切酶TaqⅠ、10×酶切反应缓冲液、2.5%琼脂糖、1×TBE、6×上样缓冲液、DNA Marker。
2、微量加样器、PCR自动热循环仪。
【实验步骤】（10min）
一、PCR反应
50ul反应体系成分如下：
模板DNA（100 ng/ml） 2ul
Taq DNA聚合酶mix 25ul
PRMT6上下游引物 各2ul
ddH2O 加至终体积 19ul
PCR反应循环参数：
98℃ 1min30s；
98℃ 5s、
54℃ 5s、
72℃ 5s，
共34个循环；
72℃ 10s。
反应结束后，置4℃保存。
【注意事项】
1、严格按照PCR反应体系和反应条件加样。
【布置作业】（1min）
书写实验报告、讨论PCR-RFLP原理
【辅导学生实验】（90min）：
教师巡回指导学生。
【总结实验】（2min）
板书提纲
一、PCR-RFLP原理
二、PCR反应体系
三、PCR反应温度
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