| 【课前复习】（1min）
回顾上次课抽血接种培养过程，教会同学们观察自己培养的血细胞生活状况如何。
【新课引入】（1min）
上次课我们接种了细胞，这次课我们就要利用这个细胞进行染色体制备。
【讲解、学生操作】（117 min）
这次实验课步骤较多，中间又有许多等待的时间，所以我们边做边讲。下面我们先进行第一步收集细胞。这是装有大家上周五培养的血细胞的青霉素小瓶，我们首先观察一下细胞的生长状态，该瓶中分两部分，上面的液体部分，主要包括培养液（1640、小牛血清、双抗、PHA、肝素、秋仙），下面的固体部分主要包括各种血细胞（红细胞、白细胞、血小板），底部红色即为红细胞，其上面有一层绒绒的物质，即为白细胞，你轻轻的荡一下上清液，就能将之荡起，能够看到这白色烟雾，就说明你培养的白细胞很多，这正是我们今天需要的细胞。将青霉素小瓶中的全部物质转移至10ml离心管（其实我们今天用的是10ml的塑料EP管），上面没有刻度，每个同学用一管，装一瓶青霉素小瓶中的物质。先用吸管进行混匀。吸管在你们桌上的试管架上，请注意，有些吸管上贴有标签，这是专用吸管只能用于标签所示液体的吸取，不能混用。我们用没有标签的吸管进行混匀，先将吸头捏闭，然后将吸管伸入到刻度离心管中对着沉淀物，松开吸头，再捏闭，再松开，反复进行，同时将吸管逐渐上升，又逐渐下降，直至混匀。只要混匀即可，不要反复混匀，以免破坏细胞和浪费时间。混匀后，放入离心机中离心以收集细胞，离心时平衡很重要，即对称的两离心管的质量要求基本相等，否则会造成离心机的甩出，甚至爆炸。这是自动配平的离心机在一定范围内可以自动配平，但要注意，①离心管一定要对称放置（示图），且对称放置的离心管质量要接近；②离心管放至离心筒的底部；③停止转动后方可开机。另外，全班同学要一起离心，不准任何人单独离心，而且要我检查后才可进行离心，离心机有五台，6个同学用一台。我们用1000r/min 离心8min，先定转速（已经定下），再定时间。（机前示范）
等离心完成后，取出离心管，弃上清液于废液缸，就得到细胞沉淀，具体方法等离心结束后给大家演示。收集到细胞后就进行低渗，低渗液是0.075mol/L 的氯化钾溶液，放在后面的恒温水浴箱中，已浴热至37℃。待会儿，大家到后面取出已浴热了的低渗液，用低渗液瓶上的滴管将低渗液加入到自已的离心管内，加至8ml即可，离心管上没有刻度，我们加到离管口1cm处，这儿就是8ml处（平视离心管），然后，用吸管将其混匀，放入恒温水浴箱中的试管架上浴热30分钟。（离心时间到，演示吸取上清液）：用自己的吸管进行，先在离心管外捏闭吸头（很重要），再伸入到管内上清液里，注意不要靠近细胞沉淀，松开吸头后，便吸取了上清液，取出吸管，在废液缸口外，捏闭吸头，将上清液弃于废液缸内，如此反复进行，就将上清液弃去，得到细胞沉淀。需注意：①吸头一定不能在离心管内捏闭，否则就会打散细胞；②上清液一定不能吸完，要留少许在管内，否则会将细胞吸出，导致实验失败；③吸管不能伸入到废液缸内，避免污染吸管。
由于低渗要等25分钟，我们就利用这个时间，系统的来讲解这个实验。请翻到实验指导书的6页。
第一步：收集细胞。将青霉素小瓶中的5ml含细胞的培养液转移至10ml离心管，1000rpm离心8min。弃上清，得沉淀。
第二步：低渗处理。我们已经做了。低渗的作用是1、使红细胞破裂；2、使白细胞膨胀，染色体分散，便于制片后观察染色体。低渗处理很重要，若低渗处理不充分，染色体分散就不良，制片后染色体团在一起影响观察；若低渗过度，则会使大量细胞破碎，导致染色体丢失。
低渗过后，打散细胞的操作应适当轻柔，避免细胞破碎，但也不要过度轻柔，否则细胞团块不易打散。
第三步：预固定 低渗时间到了以后，取出离心管，用专用吸管直接加入新配制的甲醇、冰醋酸（3∶1）固定液1ml，再用自己的吸管轻轻吸打混匀进行预固定。预固定的作用是：使细胞表面轻微固定，防止固定后的细胞粘连成块而不易打散，也就是使细胞在固定前先有一个适应过程，避免固定时细胞反应过度，而粘连成块。另外，在一定程度上预固定也可防止离心时细胞破裂。当混匀预固定液后，就将离心管放入离心机中，以1000转/分钟离心8分钟，然后，弃去上清液，就得到细胞沉淀，这一步离心后所得的沉淀很少，所以，在吸取上清液前，应先看清沉淀所在位置后（对着灯光看），再进行吸取，避免将细胞吸走，而且上清液一定不要吸干，要留少许在试管内。（如果看不见沉淀，还是按上述要求进行实验，弃去大部分上清液，留少许在试管内。）
离心的时间要大家将低渗液全部放回水浴箱内。
第四步：固定 在离心管内加入新配制的甲醇、冰醋酸（3∶1）固定液至8ml（用专用吸管），自己的吸管吸打混匀后室温下固定20分钟。固定的作用是防止染色体腐败，使其结构尽量保持原状。如果固定作用过强，染色体就会扭曲；而固定作用不足，染色体就会出现毛刷状。两者都会影响最后的制片效果。固定时间到后，就以1000转/分钟离心8分钟，弃去上清液，得到细胞沉淀。
第五步：滴片 在离心后的细胞沉淀中加入固定液0.5ml—1ml(视细胞多少而定，细胞太少可只加1、2滴)，吸管吸打混匀，制成细胞悬液。准备滴片，1、首先将酒精灯点燃；2、到讲台上领取冰冻载玻片，一人一片，（演示拿取方法）用左手拿一端勿污染滴片面、平拿、不要将其上的冰水甩干。3、用自己的吸管吸取细胞悬液，（演示）于一定高度垂直滴2~3滴于冰冻载玻片中部（接近同一部位），立即用嘴吹散细胞，将载片快速在酒精灯外层火焰上过3~4次，甩干多余水份，将载玻片滴片面，手拿的那一端，用吸水纸擦干（切记滴片处不能擦），再用记号笔写上班级、学号后，上交（正面写利于辨认玻片正、反面）。
操作完后，将自己所用的滴管、离心管洗干净，废液倒掉，废液缸洗干净，桌上所有仪器放整齐，离心管上交后方可离去。注意：最后两节课时，还要求同学们倒掉固定液（不用清洗）。
第六步：染色 将上次课制好的片子放入Giemsa染液缸里染色约10分钟。Giemsa染液是由1份Giemsa原液∶9份PH6.8磷酸缓冲液配制而成。放片时应注意玻片标本相互间不能贴附在一起，否则取片时会摩擦造成细胞脱落。（让同学们进行染色，在等待的时间继续讲）染色完毕后，将标本从染缸里取出，用自来水冲洗，去除残余染料，冲洗时注意，水流不能太大（细水流），从玻片旁边冲洗，不要对着细胞冲洗。冲洗后，用电吹风吹干标本后镜检。
先将制好的玻片标本有细胞面朝上置于低倍镜下观察，寻找染色体分散好的中期分裂相，移至视野中央，然后换高倍镜观察。观察的内容有两项，一是计数，二是观察形态。
1、细胞中染色体的计数：为了避免计数时重复和遗漏，在计数前应按该细胞的染色体自然分布状态，大致划分为几个区域（分区原则：就近划为一组），然后按顺序数出各区染色体的实际数目，最后加在一起，即为该细胞的染色体总数。人体2倍体细胞染色体数目为2n=46。
2、染色体形态特征观察：我们所用人体的染色体有三种类型：亚中着丝粒染色体、近端着丝粒染色体和中央着丝粒染色体。中央着丝粒染色体是指着丝粒位于染色体纵轴的4/8-5/8处；近端着丝粒染色体是指着丝粒位于染色体纵轴的7/8—近末端处，短臂很短；亚中着丝粒染色体是指着丝粒位于染色体纵轴的5/8—7/8处，长短臂明显不同。
对计数和形态特征观察我们都不作特殊要求，大家尽量去观察就行了。后面示教镜所示的也是人体外周血细胞染色体，可以先看示教镜再自己寻找。看看自己的制片是否成功，如果不成功是什么原因？
【课堂小结】（1min）
总结本次课运行情况，强调染色体制备各步骤所用试剂的作用。
【板书提纲】
一、目的要求
1、初步熟悉人类外周血染色体制作方法。
2、了解染色人类染色体核型。
二、内容步骤
（一）抽血培养
1、培养基成分
2、抽血步骤
3、接种培养步骤
（二）人类外周血染色体标本的制作
1、秋水仙素处理
2、取材
3、收集细胞 吸打使其分散，离心（1000r/min ，8min）。
4、低渗处理 加入预热至37℃的低渗液至8 ml，吸打混匀，恒温水浴30min。
5、预固定 加入固定液1ml，吸打混匀，离心。
6、固定 加入固定液至8ml，吸打混匀，固定20min，离心。
7、滴片 加入固定液0.5ml—1ml，吸打混匀。吸取细胞悬液滴2~3滴于冰冻载玻片上(平拿)，用嘴吹散细胞，载片快速在酒精灯外焰上过3~4次。写上班级、学号，上交。
8、染色 将制好的片子放入Giemsa染液缸里染色10min后自来水冲洗，用电吹风吹干标本后镜检。
（三）人类外周血染色体标本的观察
玻片标本有细胞面朝上置于低倍镜下观察，寻找染色体分散好的中期分裂相，移至视野中央，然后换高倍镜观察（计数、形态观察）。
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