课程

遗传学实验技术

题目

实验三 人类外周血淋巴细胞培养

学时

讲授

实验

3

练习

行课时间

2015年5月28日第6-8节

课次

第3次

教 材

《医学遗传学实验指导》第3版，主编：王修海，科学出版社，2012

教 具

多媒体，粉笔，实验材料

教 学

目 的

要 求

1、掌握无菌操作的关键技术。

2、熟悉人类外周血淋巴细胞体外培养方法。

3、了解细胞培养的基本常识。

教学重点

难点及其

解决方案

重点：1、无菌技术。

难点：1、抽血。

      2、接种。

解决方案：1、请校医院的专业护士来抽血。

2、示范细胞接种过程。

参 考

资 料

1、杨抚华.医学生物学（第七版）.北京：科学出版社,2011

2、梁素华.医学遗传学（第三版）.北京：人民卫生出版社，2013

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

【课前复习】（1min）

评讲上次报告中存在的典型问题，表扬完成较好的同学。

【新课引入】（1min）

这是一次大实验，分两次进行。第一次，抽血培养；第二次，染色体制片，染色观察。

通过染色体的制片分析，可以诊断很多种疾病，如：白血病、脆性X染色体病、先天愚型等，特别是对肿瘤的诊断，都可以通过染色体分析进行进一步的确诊。如果取母体羊水细胞进行培养制片，还可以对胎儿进行出生前诊断。

【讲解】（37 min）

观察计数染色体最佳时期是有丝分裂中期，所以首先必须找到正在进行分裂的细胞。而人体正在进行分裂的细胞只有各种干细胞，如造血干细胞、神经干细胞、表皮干细胞。除了造血干细胞位于骨髓中，还可以抽骨髓分离得到外，其他干细胞根本无法获取，就是抽骨髓进行染色体检查，病人也是不太愿意的。后来科学家们找到了一种物质，解决了这一难题。它叫植物凝集素（PHA），它可以使已分化的淋巴细胞重新返回细胞周期，进行细胞分裂。因而人们可以通过抽血，用血液中的淋巴细胞进行染色体制备了。但是同学们想一想，人体细胞的细胞周期大约为24小时，而其中分裂期只有2小时，中期还只是分裂期中的一个小时期，如果在任一时间点抽取细胞，其中绝大多数细胞肯定都是间期细胞，不能用于观察染色体。这时，人们又发现了另外一种物质，它叫秋水仙素，它可以特意将细胞中断于细胞分裂的中期，当我们培养一定时间后就可以获得大量中期细胞，用于染色体的制片。

体外培养细胞必须为细胞提供与体内生长环境尽可能一样的环境。我们今天培养血细胞所用的培养基由以下成分组成：1640基础培养基4ml；小牛血清1ml；双抗（青霉素100U/ml，链霉素100U/ml）；PHA200μg/ml。PH值为7.2，培养温度为37℃。我们用完全封闭的方法进行培养，也就是当在培养基中接种了血细胞之后，要用封口膜将瓶口封严，不需要与培养箱进行二氧化碳交流。

今天的具体实验操作如下：首先抽血，八个同学一组，抽其中一个同学的血，尽量抽男同学的血，因为男同学的血管明显些。被抽血的同学先用肥皂洗净手臂至肘关节部位，抽血的同学先点燃酒精灯，在酒精灯火焰周围10cm球形范围内为绝对无菌空间，抽取肝素的操作就必须在这个空间中进行。然后撕开2.5ml一次性注射器活塞头一端，取出注射器，在火焰附近取下塑料针尖套，洗入0.2ml肝素润湿针筒，再套上针尖套。然后给被抽血同学扎上压脉带，消毒进针部位（先一次碘酒，再两次酒精消毒）。被抽血者握紧拳头，使血管暴露更明显。然后右手大拇指和中指握住针筒，食指按住针尾部与针筒结合的地方，针尖开口平面向上平行于血管斜向进针，针尖进入血管，则针内立即会有血液出现，此时换手，左手把持针筒，右手向后拉活塞，抽取2ml血液，到达刻度后，用一根干棉纤压住进针部位，拔除注射器针头，放开压脉带，套上针套，到无菌间分装到8个青霉素小瓶中即可，每个小瓶中滴12滴血液。封口膜封口后，写上自己的学号，每个同学一瓶，1号同学记作1。放入培养箱中培养72小时。结束培养前3-4小时加入秋仙。我们下次实验时间是周一下午14:30，因此早上10:30就加秋仙，全班的都由科代表一人帮大家加就行了。

【学生操作】（80min）

指导学生抽血，然后带入细胞培养间接种。

【课堂小结】（1min）

总结本次课运行情况，强调细胞接种时的注意事项。

【板书提纲】

一、目的要求

1、初步熟悉人类外周血染色体制作方法。

2、了解染色人类染色体核型。

二、内容步骤

（一）抽血培养

1、培养基成分

2、抽血步骤

3、接种培养步骤

讲授法

〈进入新课〉

以提问方式层层递进，阐述制备染色体所需细胞种类。

边演示边讲解

边讲边示教

主板书一直保留，副板书即写即擦。