课程

微生物工程

题目

综合性实验二 链霉菌发酵实验（3）

学时

讲授

0

实验

3

练习

0

行课时间

2015年 6月26日 星期五 第6节至8节

课次

第16次

教 材

自编讲义

教 具

黑板、粉笔、PPT、视频

教 学

目 的

要 求

掌握：制备摇瓶种子培养基的方法以及种子扩大培养技术；摇瓶发酵培养的原理和方法；抗生素抑菌性能的测定方法；

熟悉：发酵罐的构造及功能；发酵罐的灭菌方法；

了解：发酵过程参数的监控方法。

教学重点

难点及其

解决方案

重点：菌种的活化及灰色链霉菌的摇瓶种子制备

难点：无菌操作；

解决方案：在实验操作之前，强调无菌操作的重要性，并及时纠正学生的错误操作。

参 考

资 料

1、刘如林.《微生物工程概论》，南开大学出版社，1995.

2、梅乐和. 姚善泾、林东强. 《生化生产工艺学》，科学出版社，2001.

3、吴松刚.《微生物工程》，科学出版社，2004.

4、焦瑞身. 《微生物工程》，化学工业出版社，2003.

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

链霉菌发酵实验——灰色链霉菌发酵产物活性测定

一、实验注意事项

    1. 培养基配制的注意事项；

    2. 无菌操作的注意事项；

二、实验操作：

1. 枯草芽孢杆菌菌悬液的制备 将枯草芽孢杆菌接种于营养琼脂培养基斜面，在35~37℃培养7天，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用无菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。

2. 上层培养基的准备  将已灭菌的生物测定用培养基100mL，融化后放入50℃恒温水浴中，待温度平衡后，加入枯草芽孢杆菌菌悬液5mL，充分摇匀，备用。

3. 平板的制作  取灭菌培养皿，每皿用大口移液管吸入50℃左右的测定培养基20mL，水平放置，待凝固后用大口移液管吸入上层培养基5mL，将培养皿来回倾侧（要迅速），使含菌上层培养基均匀分布，凝固后备用，双碟不得少于4个。

4. 放置小钢管  放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。可在试验前在双碟的底上用尺测量，作好标记，试验中可以按照双碟底面标记放置小钢管，避免放置位置不恰当产生的问题。小钢管放置时，要小心地从同一高度垂直放在菌层培养基上，不得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的方法。放置之后，不能随意移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开始滴加抗生素溶液。
5 滴加抗生素溶液  滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二剂量法，S代表标准品，T代表供试品，H代表高浓度，L代表低浓度）的顺序滴加，在一双碟对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶

结合PPT及教学视频，将无菌操作的技能及注意事项进行讲解。

要求学生对分析天平进行正确使用。

要求学生的无菌操作

总结归纳

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

液，其余2个小管中滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高低浓度的剂距为2:1或4:1。液面应该与小钢管管口齐平，液面反光呈黑色。（抗生素液体加入量不能按滴计算，即使同一滴管，每滴的量也有差异。）如果抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片小心吸去多余部分。

6 双碟中菌株的培养  滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。双碟在35℃~37℃下培养约14~16h。时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。在培养过程中，如果温度不均匀（过于接近热源），会造成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放也不能超过3个。培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。应经常注意温度，防止意外过冷过热。

7 抑菌圈测量

7.1 试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在18～22mm的菌液浓度为试验用浓度（菌液浓度约为106个/mL）。批量试验中后期，菌液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。

7.2 用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下测量。不宜取去小钢管再测量，因为小钢管中残余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈变得模糊。不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。记录测量结果后进行效价计算。

四、实验总结（10´）

1、总结本次课学生的表现情况；

2、总结学生的操作情况；

3、实验室卫生打扫布置。