课程

微生物学实验技术

题目

土壤放线菌和真菌的分离计数

学时

讲授

实验

3

练习

行课时间

2014年11月27日第3节至5节

课次

第4次

教 材

《微生物学实验教程》第一版，主编：张尔亮，西南师范大学出版社，2012

教 具

教 学

目 的

要 求

1.掌握放线菌和真菌稀释分离技术、划线分离技术，平板倾注法、涂布法和斜面接种技术；

2.熟悉从样品中分离、纯化出所需菌株，平板菌落计数法；

3.了解培养放线菌和真菌的培养时间和培养条件。

教学重点

难点及其

解决方案

教学重点: 土壤稀释液的制备、无菌操作技术

教学难点: 稀释平板计数

解决方案：通过实验学生反复训练，对于最后的实验结果教师举例进行分析

参 考

资 料

[1] 钱存柔，黄仪秀. 微生物学实验教程. 北京：北京大学出版社，1999.

[2] 沈萍编. 微生物学实验. 北京：高等教育出版社，2002.

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

实验五 土壤放线菌和真菌的分离计数

一、实验原理（20min）

放线菌与细菌同属原核微生物，是重要的抗生素产生菌，在土壤中的数量仅次于细菌，尤其是在有机质丰富、透气性好的中性到微碱性土壤中的数量较多。本试验采用高氏一号琼脂培养基分离和计数菜园土中的放线菌。

真菌在土壤中的数量次于细菌和放线菌，主要在有机质丰富、透气性好的偏酸性土壤中较多。分离土壤中的真菌并不难，但由于其菌落大容易扩散，计数准确性较低。本试验采用加有氯霉素或庆大霉素和孟加拉红的马丁氏培养基分离计数菜园土中的真菌。在此培养基上，放线菌和细菌被氯霉素或庆大霉素和孟加拉红所抑制，但大多数真菌能够生存，且其菌落受孟加拉红的抑制而较小，从而避免了某些真菌的扩散蔓延而带来的数量上的误差。

二、实验器材及方法（100min）

实验器材：

1、 培养基：高氏一号琼脂培养基、加有氯霉素或庆大霉素和孟加拉红的马丁氏培养基

2、 土样

实验方法：

土壤放线菌的分离计数

土壤稀释液的制备按稀释平板计数法中的方法进行，将土样稀释至10-5。在稀释时可在盛无菌水的三角瓶中加10滴100g/l的石炭酸溶液和50ug/ml的制霉菌素以抑制细菌和真菌的生长。分离采用稀释平板分离法：选用10-2、10-3、10-4、三个稀释度进行涂抹平板培养法，于28-30度培养4-5天。从长有单菌落的平板中选取分离较好的放线菌菌落转接斜面，并同时制片作纯度检查，若不纯，应进一步挑取该菌落采用划线分离或制成菌悬液进一步作稀释分离直至获得纯培养为止。挑取每皿菌落数在30-300之间的平板用于计数。将分离到的放线菌接到高氏一号斜面上于28-30度培养5-7天，待长好后置于冰箱中保存。

土壤真菌的分离计数

土壤稀释液的制备按稀释平板计数法中的方法进行，将土样稀释至10-4。分离采用稀释平板分离法：选用10-1、10-2、10-3三个稀释度进行涂抹平板培养法，于28度培养3-5天。从长有单菌落的平板中选取典型的真菌菌落转接斜面，并同时制片作纯度检查，若不纯，应进一步挑取该菌落采用划线分离或制成菌悬液进一步作稀释分离直至获得纯培养为止。挑取每皿菌落数在10-100之间的平板用于计数。将分离到的真菌接到PDA斜面上培养，待长好后置于冰箱中保存，必要时进行深入研究。

三、关键步骤及注意事项：注意无菌操作。 

讲授法

强调选择培养基

讲授法