实验三 培养基制备与消毒灭菌
一、实验原理(15min)
培养基是人工配制的供微生物生长繁殖和合成代谢所需要的营养物质,包括碳源、氮源、无机盐、生长因子和水。适宜的培养基除了含有细菌生长和繁殖所需的营养物质,还要有合适的酸碱度,澄清且无菌。培养基按其物理性状分为固体、半固体和液体培养基。按其用途,可分为基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基及厌氧培养基等。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。
高压蒸汽灭菌法是灭菌效果最好,使用最广泛的方法之一。
二、培养基的制备方法(60min)
牛肉膏蛋白胨培养基配方:
牛肉膏 5g 蛋白胨 10g
氯化钠 5g 琼脂 20 g(液体培养基不加) 水 1000ml
操作步骤:
1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌
2.高压蒸汽灭菌:加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物
三、实验室常用消毒灭菌方法(40min)
生物超净工作台的使用
高压蒸汽灭菌锅的使用
四、关键步骤及注意事项(5min)
1.注意按照配方配制培养基;固体培养基需要加入2%琼脂。
2.高压灭菌时要注意充分排出冷空气后再关闭排气阀;灭菌完后取物前一定要将压力降到零点。
实验四 无菌操作与接种技术
一、实验原理(15min)
细菌的接种方法因各种培养基不同而异,常用的方法有平板、斜面、液体和半固体接种。
二、实验材料及方法
实验材料
1.琼脂斜面、琼脂平板、肉汤培养基。
2.葡萄球菌、大肠杆菌斜面培养物。
实验方法
(一)平板接种法(50min)
1.分区划线法:
(1) 烧灼接种环,冷却后,取1环接种菌液。
(2) 打开平板盖,左手斜持平板(约45°角),并靠近火焰,以免空气中杂菌落入平板内,右手握持已沾菌液的接种环在琼脂平板一端连续平行划线(约占平板面积的1/3),为第1组线。划线时,接种环与平板成30~40°,轻轻接触平板,以腕力平行滑移接种环,注意避免将环嵌人琼脂将其划破。
(3) 转动平板约70°,接种环烧灼灭菌冷却后,从原接种处通过2~3条线,划于另一个1/4的面积为第2组线。划毕,接种环又烧灼灭菌,冷却后同法划出第3、4组线。
(4) 接种完毕,盖上皿盖,于皿底做好标记,将平板倒置(平板底面朝上),置37℃培养18~24h,观察结果。
分区划线法(左)及菌落分布示意图(右)
2.平行划线法:
平板连续划线法(左)及菌落分布示意图(右)
(二)琼脂斜面接种法(25min)
多用于纯种细菌的增菌和保存菌种。
1.用灭菌接种针取细菌培养物少许。
2.拔出培养管硅胶塞,管口经火焰灭菌,将沾有细菌的接种针伸入试管中。
3.将接种针自下而上在琼脂上平行划线。
4.接种后,管口在火焰上灭菌,塞回硅胶塞,接种环灭菌。
5.在试管壁近管口处做好标记,置37℃培养18~24h,观察结果。
(三)肉汤接种法(25min)
用于增菌。
1.灭菌接种环取细菌培养物少许。
2.以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤管中,将环上细菌轻轻研磨于接近液面的管壁上,然后将试管稍倾斜,使肉汤碰及细菌,将细菌带入培养基中。
3.接种后管口灭菌,塞回硅胶塞,接种环灭菌,并做好标记,置37℃培养18~24h,观察结果。
三、关键步骤及注意事项(5min)
1.接种时注意打开的试管或平板口要置于酒精灯外焰2厘米范围内,避免污染杂菌。
2.任何接种工具在进入纯培养或无菌器物之前都要严格烧灼灭菌;烧灼前最好用酒精消毒棉擦拭接种工具,然后烧灼。
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