| 实验八 土壤中脂肪酶产生菌的筛选及鉴定
一、实验原理（30分钟）
脂肪酶是类脂化合物分解、合成和酯交换的催化剂，在有机相中脂肪酶可以完成酯化、交换及转酯等反应。具有区域选择性、立体选择性、较高的稳定性．尤其是它的立体选择催化特性．可以完成用化学法难以进行的消旋化合物的拆分、不对称合成等，使这一古老的酶在有机合成、精细化工、药物中间体合成以及生物能源等诸多领域有着崭新而广阔的发展前景。脂肪酶在微生物界的分布很广，几乎所有的微生物都能产生脂肪酶。芽孢杆菌脂肪酶是细菌中产生的脂肪酶的之一，具有能耐受较高的温度、较宽的pH作用范围和对有机溶剂良好的耐受性等特点，非常适用于非水相的催化 。鉴于目前对芽孢杆菌脂肪酶研究较少，以及潜在的应用价值和巨大的需求潜力，寻找新酶种和脂肪酶的扩大应用研究，具有十分现实的意义。
二、实验器材及方法
1 材料
1.1 土样 土样采集于油脂加工厂附近的土壤，共11份土样。
1.2 培养基制备（120分钟）
富集培养基（%）：(NH4)2 SO4 0.1g, NaCl 0.05g，MgSO4·7H2O 0.01g，K2HPO4 0.1g。用6 mol／L Na2CO3调pH为7.0，再加入1％ 橄榄油，蒸馏水100 ml。12l℃蒸汽灭菌20min。
平板初筛培养基（%）：(NH4)2SO4 0.2g，NaC1 0.05g，MgSO ·7H 2O 0.05g，K2HPO4 0.1g，琼脂1.5～2.0g，用6 mol／L Na2CO3调pH为7.0，灭菌后再加入橄榄油聚乙烯醇乳化液。
橄榄油聚乙烯醇乳化液:将橄榄油与2％的聚乙烯醇(聚合度1750±50)溶液按1：3(v／v)混合，4℃静置1 h后于组织搅拌机中高速匀浆3 min即得，加入量为每100 ml培养基中加人12 ml橄榄油乳化液。
罗丹明B显色培养基：在配制好的平板初筛培养基中每100 ml加人10 ml(0．1 mg／m1)罗丹明B作为指示剂。
营养琼脂：NaC1 0.5g，蛋白胨1.0g，牛肉膏0.3g，琼脂1.5～2.0g，H2O 100ml，pH7.0
2 方法
2.1 富集方法 （80分钟）
将采集的土样各称5g溶于10m无菌水中，充分摇匀，静置片刻，让较大土壤粒沉淀后，取上层液体1 ml于装有20 ml富集培养基的100 ml三角瓶中，30℃ ，180 r／min，振荡培养2d后，将富集培养基摇匀，取1 m1转接到新的富集培养基中，二次富集，同样条件下振荡培养2d后，进行3次富集。在培养的过程中，每24 h要观察培养基的pH下降情况，理论上pH下降越大越优。
2.2 初筛方法 （70分钟）
取富集菌液1 ml加入到9 ml无菌水中稀释成10-1。，依次稀释到10-7，取10-2，10-5，10-6，10-7。四个梯度各200µl，分别涂布在罗丹明B显色培养基中。30℃培养箱中培养2～3d。
初筛培养后，在紫外灯波长为365nm下观察，将变色圈较大的菌落划线分离纯化，挑至营养琼脂斜面上保藏。
2.3形态学鉴定（60分钟）
观察菌落形态，以及细菌革兰氏染色后的菌体形态。
三、关键步骤及注意事项
注意无菌操作。
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