| 实验七 乳酸菌的分离鉴定及酸奶的制备
一、实验原理（30分钟）
酸奶是以新鲜的牛奶为原料，经过巴氏杀菌后再向牛奶中添加有益菌（发酵剂），经发酵后，再冷却灌装的一种牛奶制品。目前市场上酸奶制品多以凝固型、搅拌型和添加各种果汁果酱等辅料的果味型为多。酸奶不但保留了牛奶的所有优点，而且某些方面经加工过程还扬长避短，成为更加适合于人类的营养保健品。
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。
二、实验器材及方法
2.1 实验器材
(1)菌种：新鲜乳酸饮料(花花牛乳；含保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌)。
(2)试剂：脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g；
(3)仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超净工作台、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿、试管、300ml三角瓶、移液管、天平、牛角匙、电炉、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、线绳、标签、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯、酒精灯、石棉网、接种针（环）、擦镜纸
2.2 ＢＣＧ培养基的配制（120分钟）
配制BCG牛乳培养基，分装三角瓶，包扎，灭菌备用。
BCG牛乳培养基配制：A溶液：脱脂乳粉100g,水500ml，加入1.6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min。（1.6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）
B溶液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g，PH6.8，121℃湿热灭菌20min。以灭菌操作趁热将A溶液和B溶液混合均匀
2.3 倒平板、划线法培养菌种（30分钟）
3.3.1倒培养基
在无菌室，先用紫外线照射半小时把表面菌灭了，在通风10min后，每培养皿倾注约15ml左右已溶化的BCG牛乳培养基，立即放在桌上摇匀，冷却凝固后即成平板。
3.3.2十倍稀释法
将检样充分摇匀后，用十倍稀释法稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5各种稀释度的样品液。目的是为了确定哪个稀释度最适宜。一般在培养基上长处50-300个菌落的稀释度为最佳。
3.3.3 培养
在BCG牛乳培养基琼脂平板上划线分离，每稀释度做两个平皿。置40℃培养箱中培养48h。如出现圆形稍扁平的黄色菌落及周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
2.4 菌种的鉴别（30分钟）
(1)观察菌落大概判定是哪种菌种
嗜热链球菌：菌落适中，多为乳白色，表面光滑、湿润，中间凸起，边缘不整齐。显微镜观察菌的形态呈椭球形或者圆形，大部分连在一起形成链状。
保加利亚菌：菌落较大，不光滑，通常为无色到淡白色，透明，不光滑，直径1mm-3mm，镜检为杆状，不运动。
用革兰氏染色进行观察，分离菌株。
(2)配制脱脂乳试管培养基，分装试管，包扎，灭菌备用。
脱脂乳试管培养基成分：20g脱脂奶粉，285ml灭菌水。配制好的脱脂乳培养基。
(3)选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，40℃培养箱中培养8～24h。若牛乳出现凝固，无汽泡，呈酸性，涂片镜检细胞为杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代4～6次，最终选择出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。
2.5 乳酸菌培养基的配制、接种、发酵（120分钟）
(1) 乳酸菌培养基的制作
将脱脂乳和水以1:7（W/V）的比例，同时加入6%的蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～15min，冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。即脱脂乳14.3g，无菌水100ml，蔗糖6g。
(2)接种
将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种等量混合菌液作为发酵菌剂，均以2～5%的接种量分别接入培养基质中即为饮料发酵液。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的发酵液重复分装4瓶，将瓶盖拧紧密封。
(3)发酵
将接种后的酸乳瓶置38℃培养箱中培养2或4h时。培养时注意观察，出现凝乳后停止培养。然后转入4～5℃冰箱中冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸度适中（pH4～4.5）,凝块均匀致密,无乳清晰出,无汽泡,获得较好口感和特有风味。
2.6 酸奶发酵性能的鉴定（30分钟）
根据国标及文献报道，凝乳时间、达到发酵终点时间、发酵过程中的pH值变化及成品理化指标、感官指标(色泽、气味、滋味、组织状态、黏稠度、爽滑感、颗粒感、涩感)及成品酸奶贮藏过程中 pH值的变化是反映菌种发酵性能的重要指标。因此，本研究将对以上几个指标进行研究测定，来研究各个菌种的发酵性能.
三、关键步骤及注意事项
注意无菌操作。
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