| 实验七 抗药性突变株的分离及诱变育种
一、实验原理（60分钟）
抗性突变株是指由于某些物理、化学或生物因素的作用引起微生物基因突变，从而产生具有抗性的变异菌株。它包括了抗辐射突变株、抗温度突变株、抗渗透压突变株、抗药性突变株、抗乙醇突变株和抗噬菌体突变株等。
微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是作为引发突变的诱导物。在含有一定抑制生长药物浓度的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变体就会在平板上长成菌落。经过挑取纯化，进一步进行抗性试验就可以得到所需要的抗药性菌株。为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法。本实验采用梯度平板法分离大肠杆菌的抗链霉素突变株。
二、实验器材及方法
实验器材：
1、LB培养基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠 10g/L,pH7.4。
2、大肠杆菌Strs
3、链霉素
4、移液器，1ml枪头，试管，硅胶塞，玻璃培养皿，烧杯，玻璃涂布器，水浴锅等。
实验方法：（300分钟）
1、接种大肠杆菌于 盛有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养24h。2、在热水浴中溶化LB琼脂培养基。
3、倒10ml 已溶化的不含药物的LB琼脂培养基于一套无菌培养皿中，立即将培养皿一端垫起，使琼脂培养基覆盖整个底部并使培养基表面在垫起的一端刚好达到培养皿的底与边的交界处，让培养基在这一倾斜的位置凝固。
4、在已经凝固的平板低琼脂一边标示“100”，放回水平位置后，再在底层培养基上加入含有100ug/ml链霉素的LB琼脂培养基10ml。凝固后，便制得一个链霉素浓度从一端的0ug/ml到另一端100ug/ml的梯度平板。
5、用移液器吸取200ul 大肠杆菌液加到梯度平板上涂布。37℃倒置培养48h。
6、选择1~2个在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环接触单个菌落朝高浓度区域划线。把平板37℃倒置培养48h。
7、将分离纯化得到的抗药性突变株进行微波诱变育种。
（1）菌液的制备：取恒温箱内37℃下培养24小时的抗药性突变株斜面，用接种环挑取细菌接种液体培养基，在160r/min、37℃的摇床上过夜，然后稀释到106个/mL，得菌液备用。
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