课程

微生物学实验技术

题目

土壤微生物的分离纯化及菌种保藏

学时

讲授

实验

3

练习

行课时间

2014年10月3日第6－8节

课次

第5次

教 材

《微生物学实验教程》，张尔亮等主编，西南师范大学出版社

教 具

教 学

目 的

要 求

掌握土壤细菌、放线菌和真菌分离纯化及菌种保藏技术；细菌、放线菌和真菌形态观察的方法；菌种保藏常用方法。

熟悉细菌、放线菌和真菌等微生物菌落的一般特征；常见细菌、放线菌和真菌的基本形态特征。

了解噬菌体的分离和纯化和效价测定；染色方法在微生物分类鉴定中的重要性。

教学重点

难点及其

解决方案

教学重点: 土壤稀释液的制备、无菌操作技术

教学难点:平板稀释涂布

解决方案：通过实验学生反复训练，对于最后的实验结果教师举例进行分析

参 考

资 料

[1] 钱存柔，黄仪秀. 微生物学实验教程. 北京：北京大学出版社，1999.

[2] 沈萍编. 微生物学实验. 北京：高等教育出版社，2002.

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

实验五 土壤微生物的分离纯化及菌种保藏

一、实验原理（20分钟）

放线菌与细菌同属原核微生物，是重要的抗生素产生菌，在土壤中的数量仅次于细菌，尤其是在有机质丰富、透气性好的中性到微碱性土壤中的数量较多。本试验分别采用牛肉膏蛋白胨培养基和高氏一号琼脂培养基分离和计数校园花圃土中的细菌与放线菌。

真菌在土壤中的数量次于细菌和放线菌，主要在有机质丰富、透气性好的偏酸性土壤中较多。分离土壤中的真菌并不难，但由于其菌落大容易扩散，计数准确性较低。本试验采用加有氯霉素或庆大霉素和孟加拉红的马丁氏培养基分离计数校园花圃土中的真菌。在此培养基上，放线菌和细菌被氯霉素或庆大霉素和孟加拉红所抑制，但大多数真菌能够生存，且其菌落受孟加拉红的抑制而较小，从而避免了某些真菌的扩散蔓延而带来的数量上的误差。

二、实验器材及方法（100分钟）

实验器材：

1、 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号琼脂培养基、马丁氏培养基（加有氯霉素或庆大霉素和孟加拉红）

2、 土样

3、 革兰氏染液、乳酸石炭酸棉蓝染液

实验方法：

土壤细菌的分离计数

土壤稀释液的制备按稀释平板计数法中的方法进行，将土样稀释至10-6。分离采用稀释平板分离法：选用10-3、10-4、10-5三个稀释度进行涂抹平板培养法，于28度培养3-5天。挑取每皿菌落数在100左右的平板用于计数。从长有单菌落的平板中选取典型的细菌菌落转接平板，进一步分离纯化，然后制片染色观察形态。将分离到的细菌接到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上培养，待长好后置于冰箱中保存，必要时进行深入研究。

土壤放线菌的分离计数

土壤稀释液的制备按稀释平板计数法中的方法进行，将土样稀释至10-5。在稀释时可在盛无菌水的三角瓶中加10滴100g/l的石炭酸溶液和50ug/ml的制霉菌素以抑制细菌和真菌的生长。分离采用稀释平板分离法：选用10-2、10-3、10-4、三个稀释度进行涂抹平板培养法，于28-30度培养4-5天。挑取每皿菌落数在30-300之间的平板用于计数。从长有单菌落的平板中选取典型的放线菌菌落转接平板，进一步分离纯化，然后制片染色观察形态。将分离到的放线菌接到高氏一号斜面上于28-30度培养5-7天，待长好后置于冰箱中保存。

讲授法

强调选择培养基

讲授法

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

土壤真菌的分离计数

土壤稀释液的制备按稀释平板计数法中的方法进行，将土样稀释至10-4。分离采用稀释平板分离法：选用10-1、10-2、10-3三个稀释度进行涂抹平板培养法，于28度培养3-5天。挑取每皿菌落数在10-100之间的平板用于计数。从长有单菌落的平板中选取典型的真菌菌落转接平板，进一步分离纯化，然后制片染色观察形态。将分离到的真菌接到PDA斜面上培养，待长好后置于冰箱中保存，必要时进行深入研究。

三、关键步骤及注意事项：注意无菌操作。 

讲授法