课程

分子与细胞实验

题目

蛋白质电泳技术及血浆蛋白电泳

学时

讲授

1

实验

2

练习

行课时间

课次

教 材

《分子与细胞实验指导》，自编教材，2015年

教 具

多媒体课件、电泳仪、醋酸薄膜电泳槽

教 学

目 的

要 求

1.掌握各种蛋白质电泳技术的基本原理和方法；

2.熟悉醋酸纤维薄膜电泳的基本操作；

3.了解血浆蛋白电泳的临床应用。

教学重点

难点及其

解决方案

重点：电泳原理及血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳操作和临床意义。

难点：1.电泳时的点样；

2.理解根据蛋白质在等电点时净电荷为零这一性质来测定其等电点。

解决：示教和理论复习。

参 考

资 料

1. 王镜岩主编，生物化学（第三版），高等教育出版社，2004年

2. 孙培龙、吴石金 主编，生物化学技术实验指导，化学工业出版社，2008年

3. 高继国、郭春绒 主编，普通生物化学教程实验指导，化学工业出版社，2009年

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

一、电泳基本原理 （10 min）

1.带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度(mobility)，可用下式表示：U=v/E=(d/l)/(V/l)=dl/Vt式中，U(也可以用m表示)为泳动度；v为颗粒泳动速度(cm/s)；E为电场强度(V/cm)；l为支持物的有效长度(cm)；V为实际电压(V)；t为通电时间(s或min)。电泳后通过侧量V,t,d,l，即可计算出被分离物质的泳动度。泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。  

2. 影响泳动速度的因素

1.电场强度

2.溶液pH

3.溶液的离子强度

4.电渗

5.温度

6.支持物

二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳（10 min）

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的 凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 

三、SDS-PAGE（25 min）

SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。

由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。

PPT讲解

举例：

重点讲解电流和电渗

提问：SDS的作用？

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。

四、醋酸纤维素薄膜电泳（25 min）

1. 醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。将之溶于丙酮等有机溶剂中， 即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度约以0.1-0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度而易碎。目前，国内有醋酸纤维薄膜商品出售，不同厂家生产的薄膜主要在乙酰化、厚度、孔径、网状结构等方面有所不同，但分离效果基本一致。 

2. 醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有以下优点：

    (1)分离效果好。对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量测定的精确性。

(2)快速省时。由于亲水性较滤纸小，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45-60min即可，加上染色、脱色，整个电泳完成仅需90 min左右。

(3)灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需2μL血清，故常用于检测在病理情况下微量 异常蛋白的改变。

(4)应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋 白等用醋酸纤维素薄膜电泳能较好地分离。

    (5)易保存，易定量。醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡 后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。

由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉。目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其他生物大分子。 

PPT

展示醋酸纤维膜电泳结果

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

3. 试剂与器材

（1）电泳仪：包括直流电源整流器和电泳槽两个部分，电泳槽用有机玻璃或塑料等制成。它有两个电极，用白金丝制成。

（2）新鲜血清（无溶血现象）

（3）巴比妥-巴比妥钠缓冲液，pH是8.6，离子强度0.06

巴比妥钠12.76g

巴比妥1.66g

蒸馏水加热溶解后再加水至1000ml

（4）氨基黑10B染色液

氨基黑10B 0.5g

甲醇50ml

冰醋酸10ml

蒸馏水40ml

（5）漂洗液

95％乙醇45ml

冰醋酸5ml

蒸馏水50ml

五、实验操作（40min）

1． 准备与点样：将薄膜切成2.5×8cm的小片。在薄膜无光泽面距一

端1.5cm处，用铅笔划一线表示点样位置。

2. 放置：将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上（缓冲液盛于   

培养皿中），使膜条自然浸湿下沉。

3.  将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的膜条取出，用滤纸吸去多余

的缓冲液，把膜条两端各贴于两块薄片上，使点样线架空。

4 . 用血色素吸管吸取新鲜血清3～5µl，涂于宽2cm的X光软片末端

处，或用软片在盛有血清的小烧杯中蘸一下，使软片下端沾上薄层血清，

然后紧按在薄膜点样线上，待血清全部浸入膜内，移开软片。

5.  电泳：将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样

面）向下，点样端置于阴极。槽架上四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴

紧，待平衡5分钟后通电，电压为10V/cm长（指膜条与滤纸桥总长度）。

电流为0.4—0.6mA/cm宽，通电1小时左右关闭电源。

6.  染色：通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的

染色液中，染5分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗

数次，直至背景漂净为止。用滤纸洗干薄膜。

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

六、临床意义（5 min）

1、正常值：

白蛋白57％—72％

α1球蛋白2％—5％ 

α2球蛋白4％—9％ 

β球蛋白6.5％—12％ 

γ球蛋白12％—20％

2、 肝硬化时白蛋白显著降低，γ球蛋白升高2—3倍；肾病综合症时，白蛋白降低，α2和β球蛋白升高。 

七、小结（5 min）

 1. 电泳的原理以及影响泳动速度的因素；

 2. 醋酸纤维素薄膜电泳的原理和优点。

布置思考题，安排学生打扫卫生