课程

生物化学与分子生物学实验

题目

肝脏DNA的提取

学时

讲授

实验

3

练习

行课时间

课次

教 材

《生物化学与分子生物实验学》，宋海星主编，科学出版社，2012年9月第一版

教 具

电子课件

教 学

目 的

要 求

1、掌握基因组DNA提取的原理和实验操作细节；

2、熟悉实验动物的取材方法及组织匀浆制备方法；

3、了解试剂盒提取质粒DNA方法和原理，离心机的分类；

教学重点

难点及其

解决方案

教学重点: 核酸分离提取技术

教学难点: 分子生物学实验操作技术

解决方案：分子生物学实验操作技术的规范性，可通过演示操作的方法进行讲解，并要求

学生反复训练，以达到规范操作、熟练操作的教学目的。

参 考

资 料

1. 《生物化学》，王镜岩主编，高等教育出版社，2002年8月第三版。

2. 《生物化学技术实验指导》，孙培龙、吴石金主编，化学工业出版社，2008年8月第一版。

《分子生物学实验技术》，屈伸、刘志国主编，化学工业出版社，2008年1月第一版。

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

课程引入：（5´）

提问：1. DNA在生物体内的存在形式？

2. 离心机使用的注意事项有哪些？

肝脏DNA的提取

一、实验原理（10´）

DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取脱氧核糖核蛋白复合物-DNP后，必须将其中蛋白去除，DNA或DNP可容于水或1M NaCl溶液，但在0.14M盐溶液中则溶解度很低，而RNA则溶于0.14M盐溶液，利用这一性质可将生物组织中的DNA与RNA分开，分离得到DNA后，其中蛋白质部分可用SDS使之变性除去（同时破坏核酸分解酶），进一步纯化则利用氯仿-异戊醇震荡除蛋白，震荡时，蛋白质变性，形成凝胶，并与DNA分开，DNA则留在水层中，利用DNA不溶于乙醇，因而用乙醇将DNA 从溶液中沉淀出来。

二、实验操作及注意事项（15´）

1．取新鲜猪肝4 g，用0.14 mol/L NaCl-0.15 mol/L EDTA溶液洗去血液，剪碎。加入10 mL 0.14 mol/L NaCl-0.15 mol/L EDTA溶液，置匀浆器中研磨。（初步破碎细胞，由实验室准备）

2．取一支10 mL EP管，装入糊状物（基本装满），离心5 min（10000 r/min），弃去上清液沉淀用0.14 mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液洗2次。每次加入溶液后用吸管吹打均匀再离心（同上），直到上清液无血细胞。弃上清液，所得沉淀为DNP（DNA蛋白复合物）粗制品。

3．向上述沉淀物加入0.14 mol/L NaCl — 0.15 mol/L EDTA溶液5 mL，分装于2支10 mL EP管，然后每管滴加25 % SDS溶液1 mL，边加边振荡。加毕，置60 ℃水浴20 min （不停振荡），直至溶液变得粘稠并略透明，取出冷却至室温。 

4．每管加入5 mol/l NaCl溶液2mL，蝴蝶形振荡5min。加入约1倍体积的氯仿—异戊醇混合液，蝴蝶形振荡10min，4000 r/min，离心10 min。 

5．吸出上清液，弃去沉淀。向上清液中缓慢加入1.5—2倍体积的95%乙醇，DNA沉淀析出，4000 r/min，离心10 min。用玻棒搅出的丝状物则为粗DNA

6、注意事项

低温：抑制DNA酶的活性

操作柔和：防止DNA断链

三、实验操作（80´）

学生分组实验

温故而新：通过提问的方式，考察学生理论知识的掌握情况，

复习法：根据提问的情况，重点复习DNA的结构特点及其相关理论知识。

讲述法：结合PPT上的图示,进行分步讲解。

讲述并演示：步骤讲解实验过程，并强调每一步的注意事项，对一些技术要点进行演示操作。

此步骤使核酸与蛋白

质分离。

注意：此步骤后溶液分三个相：上层水相（DNA）；中层变性蛋白质相；下层有机相和残余的RNA。

及时纠正学生的错误操作，提醒学生注意操作要点。

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

 板书内容

   1.实验原理

   2.实验操作流程

   3.实验注意事项

   4.小结