实验原理:
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型,具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样, 迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA,也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。
[实验步骤]
(一)制备琼脂糖凝胶
根据被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表:
琼脂糖凝胶浓度% 线性DNA的有效分离范围/kb
0.3 5—60
0.6 1—20
O.7 0.8—10
O.9 0.5—7
1.2 0.4—6
1.5 0.2—4
2.0 0.1—3
实验用1.2%琼脂糖。称取1.2g琼脂糖,放入锥形瓶中,加入100mL 1xTAE缓冲液,置微波炉或水浴加热至完全溶化,取出摇匀即可。
(二)胶板的制备
1.取干净的有机玻璃内槽,用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严,不能留缝隙)。
2.将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。
3.将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
4.待胶凝固后,小心地拔出梳子,撕下透明胶带,然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意:DNA样品孔应朝向负电极一端。
5.加电泳缓冲液至电泳槽中,加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。
(三)加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。
(四)电泳
1.接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比,一般电场强度不要超过5V/cm。
2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处,停止电泳。
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