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实验十二 琼脂糖凝胶电泳实验
2015-07-19 10:42  

      案 首 页

                               任课教师:宋海星     

课程

生物化学与分子生物学实验

题目

琼脂糖凝胶电泳

学时

讲授

 

实验

3

练习

 

行课时间

 

课次

 

教 材

《生物化学与分子生物实验学,科学出版社出版,宋海星主编,2012

教 具

多媒体课件

教 学

目 的

要 求

掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法;

熟悉琼脂糖凝胶电泳仪器;

了解实验不同结果原因及分析;

教学重点

难点及其

解决方案

重点:琼脂糖凝胶电泳原理、实验步骤

难点:电泳结果分析与鉴定

解决方案: 与理论相结合,利用实例、图片讲解。通过课堂讲授、

实验示教,加深该章内容的理解.

参 考

资 料

分子克隆(冷泉港出版社)、基因(第八版)

实 施

情 况

小 结

 

 

 

教研室主任签名:                             

 

      案 续 页

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

实验原理:

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型,具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样, 迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA,也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。  

[实验步骤]

    (一)制备琼脂糖凝胶

    根据被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表:

    琼脂糖凝胶浓度%      线性DNA的有效分离范围/kb

       0.3                       5—60

       0.6                       1—20

       O.7                     0.8—10

       O.9                     0.5—7

       1.2                     0.4—6

       1.5                     0.2—4

       2.0                     0.1—3

实验用1.2%琼脂糖。称取1.2g琼脂糖,放入锥形瓶中,加入100mL 1xTAE缓冲液,置微波炉或水浴加热至完全溶化,取出摇匀即可。

(二)胶板的制备 

1.取干净的有机玻璃内槽,用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严,不能留缝隙)。

2.将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。

3.将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。

4.待胶凝固后,小心地拔出梳子,撕下透明胶带,然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意:DNA样品孔应朝向负电极一端。

5.加电泳缓冲液至电泳槽中,加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。

 (三)加样

    用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。  (四)电泳

1.接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比,一般电场强度不要超过5V/cm。

2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处,停止电泳。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

      案 续 页

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

(五)染色

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE缓冲液中加两滴2mg/mL的溴化乙锭储存液即可),在脱色摇床上缓慢摇动下染色20-30分钟。注意:溴化乙锭为致癌物,须戴一次性塑料薄膜手套操作,并小心污染环境。

 

[实验结果]

    在紫外灯(360nm254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜,以防紫外线对眼睛的伤害作用)

 

 

 

 

 

 

 

讲授:不同结果对应各种情况及分析

 

 

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