课程

生物化学与分子生物学实验

题目

HBV病毒实时荧光定量PCR

学时

讲授

实验

3

练习

行课时间

课次

教 材

《生物化学与分子生物实验学》，宋海星，科学出版社，2012年

教 具

多媒体课件

教 学

目 的

要 求

          1.掌握血清中HBV-DNA的提取方法及原理，HBV-DNA实时荧光定量PCR的测定原理，HBV-DNA半定量PCR和实时荧光定量PCR结果及分析。

          2.熟悉实时荧光定量PCR的分类和灰度分析软件的使用。

          3.了解核酸测定引物设计原理，实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作。

教学重点

难点及其

解决方案

教学重点: 血清中病毒DNA的提取方法和原理

教学难点: 实时荧光定量PCR的测定原理

解决方案：基本操作技术通过采取面对面，一对一的形式进行教学指导，鼓励学生反复训练

参 考

资 料

1. 王镜岩主编，生物化学（第三版），高等教育出版社，2004年

2. 孙培龙、吴石金 主编，生物化学技术实验指导，化学工业出版社，2008年

3. 高继国、郭春绒 主编，普通生物化学教程实验指导，化学工业出版社，2009年

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

一、实验原理 （25 min）

    Real time PCR 是普通PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质，使得DNA的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。即对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测。该方法精确、灵敏、特异性强、污染途径小、自动化程度高、操作简单。是国际公认的核酸分子定量的标准方法。它已逐渐代替了Northern blotting 以及semi RT-PCR技术。

    本实验从HBV携带者或者乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA，采用核酸扩增结合TaqMan荧光探针技术, 利用一对乙肝病毒特异性引物和一特异性结合于扩增区另一位点的TaqMan探针, 实现对乙肝病毒模板的扩增和检测。使用商品化试剂盒：HBV实时荧光定量试剂盒，深圳匹基公司（PG，Biotech.）。针对表面抗原S基因，设计一对引物和一个探针。

TaqMan荧光探针技术中，两个荧光染料标记在探针上，一个叫报告基团（R），一个叫淬灭基团（Q）。当两个荧光基团都连在探针上时，报告基团的荧光被淬灭基团抑制。在延伸中，DNA聚合酶利用5’→3’外切酶活性把报告基团从探针上切下来。一旦和淬灭基团分开，报告基团释放出荧光。通过监测荧光信号的积累来反映乙肝病毒DNA的扩增.产物的积累，根据扩增反应的动力学特征使用外部标准曲线对初始模板定量。

二、试剂与器材（10 min）

1．HBV-DNA检测试剂盒：DNA提取液1，DNA提取液2，PCR预混合液（含有Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dUTP、dGTP、dCTP引物、荧光标记的探针）、Taq酶、UNG，强阳性对照血清、阴性对照血清、临界阳性血清，四种不同浓度的阳性参控品、双蒸去离子水。

2．荧光定量PCR仪

3．PCR反应管

4．移液器及移液器吸头

PPT讲解

提问：DNA聚合酶的作用方向？

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

5．高速离心机

6．漩涡混合器

7．超净工作台

8．调温电热板

三、操作步骤（50 min）

1.    试剂和主反应混合物的准备：从试剂盒中取出HBV PCR反应液、Taq酶及UNG。室温融化后，2000rpm离心10sec，设需要的管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管室内质控+1管试剂空白+4管阳性参控品），40ul测试反应体系配制如下表：

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向设定的n个PCR反映管中分别加入38ul，转移至样本处理区。

2.    样本的制备和上样

（1）标本处理

取n个0.5ml灭菌离心管，做好标记。首先加入100 ulDNA提取液1，再分别加入待测血清或血浆样本（切勿吸入血细胞）以及各种对照品各100 ul，振荡混匀，13000rpm离心10min：吸弃上清（离心时注意固定离心管方向，尽可能吸弃上清且不碰沉淀）；再加入25ulDNA提取液2，振荡10sec（沉淀无需打散、混匀），100℃干浴，13000rpm离心10min，保留上清备用。如果样本裂解产物当天不使用，则要保存在-20℃。

（2）上样

若样本及对照品裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻，以13000 rpm离心5min。在所设定的n个反应管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、强阳性对照和室内质控血清、灭菌去离子水以及阳性参控品各2ul，盖紧PCR反应管管盖，并记录样本信息。

提问：Taq酶的作用？

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

（3）PCR上机扩增

检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器；检查并消除反应管底气泡。按设置装载反应管，选择或设置扩增和检测条件：选择预设的程序文件或设置为：370C：3min；940C：1min；950C：5sec，600C：30sec，40个循环，荧光信号收集设在600C。设置模板：设置孔位及荧光（详见相应仪器的操作手册）。保存数据文件并运行。

四、结果分析（35 min）

（1）设定基线：不同的PCR仪操作略有不同，按仪器说明书操作。①PE7700:分析前把标准荧光定为TAMRA。如果没有Ct<16的强阳性样品，应选3～15个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct；如果有Ct<16的样品，则将此样品定为强阳性，并将此样品从数据库中剔除，然后以3～15个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct。②ICycler：基线一般取自设值（2~10）。实验结束后，点击PCR baseline subtract选项扣除基线值。若某些曲线出现无规则的起伏跳动，应视为非正常现象，此时将其从结果中剔除（点击select wells,消除此孔彩色，然后选择display wells）。注意调整坐标，使所有曲线都在坐标内，见图5。③LightCycler：用荧光显示模式F1/F2读取结果。基线设定原则以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值不出现任何数值时为准（一般定在0.001～0.01范围内，也可以根据仪器本身的实际情况加以调整）。域值设定：以刚好高于阴性对照品的扩增曲线最高点，且阴性对照品Ct=40或Ct=0为原则，调整起始域值。

（2）实验有效性判断：检查质控和标准品应同时符合下列条件

阴性对照、试剂空白CT值都为0

强阳性对照和室内质控CT值不为0，且强阳性小于室内质控，拷贝数在105~107间。

标准品CT值小于38，且标准曲线斜率在-3.5 ~ -4.0间，截距在40 ~ 50间，相关系数小于-0.98。

   布置思考题