分子生物学实验教学大纲
Biomolecular Laboratory
（供四年制生物制药专业使用）
前 言
分子生物学是一门重要的实验性基础医药学学科。分子生物学的研究内容仍主要以核酸（基因）的分子生物学为线索，从基因展开，围绕DNA复制、转录、翻译和基因表达调控等方面予以论述，同时将分子生物学的原理、机制和技术运用于医药工业，为近代医药工业的发展服务。理论知识来源于实践研究，分子生物学的实验技术和方法不断渗入到药学研究领域，为从事新药研究奠定了基础。
分子生物学实验课教学目的是帮助同学掌握基本实验技能、基本实验操作技术，提高独立思考、独立分析和独立解决问题的能力，学会正确的科研思维方法，养成严谨的科学作风，把同学们所学得的分子生物学理论知识和实验内容相结合的重要手段。
近年来，随着生物化学与分子生物学的迅速发展促进了人们对许多疾病如恶性肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、免疫系统疾病等重大疾病的认识，随之出现了基因诊断和基因治疗的方法。可以相信，随着生物化学与分子生物学的进一步发展，必将给新药研究带来全新的理念。分子生物学实验课一方面使学生在实验中验证理论的来源与正确性、加深对理论的理解；另一方面，分子生物学实验手段又是生命科学发展的必用手段，因此分子生物学实验课是培养学生科研能力和素质的必要的、重要的过程。
本大纲使用《生物化学与分子生物学实验技术教程》，杨建雄编著（科学出版社，2008年），参考《生物化学与分子生物实验学》，宋海星编著（科学出版社，2012年）。适用于四年制生物制药专业本科使用。大纲所列教学内容可通过课堂讲授、实验、自学、讨论、计算机多媒体等等方式进行教学。划横线部分为要求学生重点掌握的内容，其他为一般熟悉和一般了解内容。总学时为36学时。
本课程属于校考课程，形式及题型应多样化，题量应适中，考试时严格考试纪律。其成绩构成是平时成绩（以实验报告为主，还包括出勤率和实验表现）40％，实验设计考核20％，课终考试占40%。
参考学时分配
| 内容
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理论学时数
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实验学时数
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| 分子生物学基本知识与操作
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3
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| 质粒DNA的制备
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3
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| RNA提取
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3
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| PCR基因扩增和琼脂糖凝胶电泳
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3
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| 质粒的酶切和连接
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3
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| 大肠杆菌感受态制备
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3
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| 转化
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3
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| 重组载体鉴定
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3
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| 重组载体的原核诱导表达
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3
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| SDS-PAGE电泳
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3
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| 定量PCR仪使用方法和结果分析
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3
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| 实验设计
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3
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| 总计
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36
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实验基本知识与操作（3学时）
目的要求
掌握实验室规则和常用分子生物学实验仪器名称。
熟悉实验室各项实验管理规定。
了解分子生物实验室发展趋势。
教学内容
1、学习并初步掌握各种常用分子生物学仪器的正确操作及一般维护，正确操作各种实验仪器设备：PCR仪,分光光度计,水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪,高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器等。
2、学习实验室各项管理规定。
3、介绍实验室发展及趋势。
质粒DNA的制备（3学时）
目的要求
掌握碱裂解法提取质粒原理；掌握细菌的培养和收集。
熟悉提取方法。
了解相关仪器设备。
实验内容
1、细菌的培养和收集。
2、质粒DNA少量快速提取、纯化和鉴定 蛋白质与DNA发生变性，质粒DNA分子迅速复性，离心沉淀。
RNA提取（3学时）
目的要求
掌握细胞中RNA的提取方法、浓度测定和反转录成cDNA的原理。
熟悉用Trizol抽提RNA的方法。
了解RNA和DNA提取的异同。
实验内容
1、Trizol 裂解细胞，抑制裂解细胞时释放的核酸酶。氯仿使RNA、蛋白质和DNA分层。异丙醇使RNA沉淀。
2、RNA提取过程中所用的枪头、EP管等均需要用DEPC水处理，除去RNA酶。
3、RNA浓度检测。
PCR基因扩增和琼脂糖凝胶电泳检测DNA（3学时）
目的要求
掌握PCR反应的基本原理、引物设计方法和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。
熟悉PCR的使用、引物设计和琼脂糖凝胶电泳仪器。
了解PCR产物不同结果原因及分析
实验内容
1、PCR引物设计的方法和注意事项。
2、PCR反应原理 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
3、PCR反应特点 具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。
4、PCR仪器的使用，PCR程序设计 预变性；变性；退火；延伸；循环；终延伸；保存。
5、其他PCR方法的类型和适用条件。
6、PCR实验条件的优化。
7、琼脂糖凝胶电泳原理 迁移率、电泳介质、不同分子的区分方法。
8、琼脂糖凝胶的制备 缓冲液配制、倒胶。
9、加样与电泳，观察和结果分析
载体的酶切和连接（3学时）
目的要求
掌握重组DNA连接方法。
掌握酶切及连接原理。
熟悉酶切反应及连接条件。
了解各种内切酶的作用靶点。
实验内容
1、连接反应 形成磷酸二酯键的过程。
2、酶切鉴定重组质粒 限制性内切酶的概念、分类；作用原理；粘性末端的设计与确定常用内切酶的酶切位点。
3、限制型内切酶的作用靶点 酶切反应的条件与操作；酶切结果的分析与鉴定。
大肠杆菌感受态细胞的制备（3学时）
目的要求
掌握大肠杆菌感受态细胞的制备的方法及技术；掌握蓝白重组体的筛选方法。
熟悉菌种操作和保存。
了解其他筛选方法。
实验内容
1、受体菌的培养。
2、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)及原理 磷酸二酯键的过程；转化效率；制备的注意事项。。
3、结果分析。
转化（3学时）
目的要求
掌握大肠杆菌感受态转化的方法及技术；掌握热激法的原理。
熟悉转化的操作和保存。
了解其他筛选方法。
实验内容
1、受体菌的培养。
2、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)及原理；转化的具体操作，转化效率；制备的注意事项。
3、转化 重组载体与感受态细胞的转化；热激法。
4、结果分析。
重组载体鉴定（3学时）
目的要求
掌握重组载体的几种鉴定方法。
熟悉重组载体鉴定步骤。
了解其他重组载体鉴定方法。
实验内容
1、重组载体的小量制备。
2、限制性酶切法和琼脂糖凝胶电泳鉴定重组载体。
3、电泳结果分析。
重组载体的原核诱导表达（3学时）
目的要求
掌握重组菌的活化、IPTG诱导的方法和原理。
熟悉菌种操作、保存和菌体活化。
了解包涵体复性原理和方法。
实验内容
1、重组菌的活化。
2、重组菌的大量培养和IPTG诱导蛋白大量表达。
3、通过室温离心收集诱导后的重组菌体，超生破碎细胞仪破碎细胞，分别收集上清液和沉淀。
4、将上清液和沉淀分别制样，SDS-PAGE电泳分析。
SDS-PAGE电泳（3学时）
目的要求
掌握SDS-PAGE的原理、考马斯亮蓝染色、脱色原理。
熟悉聚丙烯酰胺凝胶的制备、电泳流程和蛋白胶的染色及脱色。
了解蛋白胶各化学成分及其作用。
实验内容
1、样品处理及SDS-PAGE胶的制备，浓缩胶和分离胶的制备方法。
2、电泳缓冲液的制备及电泳。
3、SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色和脱色。
4、SDS-PAGE胶结果分析。
定量PCR仪使用方法和结果分析（3学时）
目的要求
掌握定量PCR仪使用方法、工作原理和结果分析方法。
熟悉定量PCR仪操作步骤和使用的注意事项。
了解定量PCR仪的发展史、溶解曲线的含义及如何减小实验误差的方法。
实验内容
1、定量PCR仪软件使用方法，引物设计的原理和方法。
2、定量PCR仪加样方式及减小实验误差的加样方法。
3、实验结果分析，Ct值、阈值的含义。
实验设计（3学时）
目的要求
掌握利用NCBI查找目的基因序列的方法及相应引物的设计。
熟悉目的基因载体克隆的方法、步骤和目的基因功能的检测方法。
了解实验设计的流程和注意事项。
实验内容
1、通过NCBI数据库查找目的基因的编码序列和克隆目的基因的引物设计。
2、目的基因重组载体的构建和鉴定。
3、目的基因功能的检测方法、实验总结及过程中出现问题的探讨。
附：
常用专业英文词汇表
| 反义核糖核酸 antisense RNA
互补DNA cDNA(complementary DNA)
表达克隆 expression cloning
足迹法 footprinting
基因组DNA genomic DNA
杂交 hybridization
内含子 intron
诱变剂 mutagen
聚合酶链反应 PCR
定位克隆 positional cloning
探针 probe
限制性内切酶 restriction enzyme
反转录酶 reverse transcriptase
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克隆 clone
克隆载体 cloning vector
表达载体 expression vector
基因组 genome
基因组学 genomics
诱导 induction
基因敲除 gene knockout
RNA 印迹法 Northern blotting
极性的 polar
引物 primer
重组DNA recombinant DNA
限制片段 restriction fragment
聚合酶 RNA polymerase
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