课程

分子生物学实验

题目

重组载体的原核诱导表达

学时

讲授

实验

3

练习

行课时间

2015年6月16日 星期二 第1-3节

课次

第9次

教 材

生物化学与分子生物学实验，科学出版社，杨建雄

教 具

PPT

教 学

目 的

要 求

 掌握外源基因IPTG诱导表达的基本原理，为原核蛋白表达纯化和SDS-PAGE分析做准备

熟悉IPTG诱导原核蛋白表达的步骤

了解诱导诱导外源基因表达的常用的方法

教学重点

难点及其

解决方案

教学重点: 外源基因IPTG诱导表达的基本原理和操作方法

教学难点: 外源基因IPTG诱导表达的基本原理

解决方案：基本操作技术通过采取面对面，一对一的形式进行教学指导，鼓励学生反复训练

参 考

资 料

1. 魏群 主编，分子生物学实验指导，高等教育出版社，2010年

2. 郑伟娟 主编，现代分子生物学实验，高等教育出版社，2008年

3、李钧敏 主编，分子生物学实验，浙江大学出版社，2009年

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

【实验原理】

外源基因在原核生物中高效表达除了有适合的载体外，还必须有适合的宿主菌以及一定的诱导因素。宿主菌的选择对外源基因的表达是至关重要的，因为外源基因(特别是真核基因)在细菌中的表达往往不够稳定，常常被细菌中的蛋白酶降解。因此有必要对细菌菌株进行改造，使其蛋白酶的合成受阻，从而使表达的蛋白得到保护。实验中常用的宿主菌是经过改造的JMl09、BL21等大肠杆菌菌株。

通常表达质粒不应使外源基因始终处于转录和翻译之中，因为某些有价值的外源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将影响细菌的生长。为此，宿主细胞的生长和外源基因的表达是分成两个阶段进行的。    

第一阶段使含有外源基因的宿主细胞迅速生长，以获得足够量的细胞；

第二阶段是启动调节开关，使所有细胞的外源基因同时高效表达，产生大量有价值的基因表达产物。在原核基因表达调控中，阻遏蛋白与操纵基因系统起着重要的开关调节作用，当阻遏蛋白与操纵基因结合时，阻止基因的转录。加入诱导物后，使其与阻遏蛋白结合，解除阻遏从而启动基因转录。根据表达载体的不同，外源基因表达常采用化学诱导与温度诱导两种方法。pET及pBV系列表达载体是近年来被广泛应用的两种诱导方式的代表性原核表达系统。

1、化学诱导 

对于pET系列表达载体当目的基因被克隆在T7转录和翻译信号控制的正确相位后，加入IPTG进行诱导，使宿主菌表达T7 RNA聚合酶，进而诱导目的基因以融合蛋白的形式进行表达，该系统以其独特的优势，在基因表达中应用较为广泛。

2、温度诱导 

pBV系列表达载体，启动子下游的目的基因直接表达受温度变化调控以非融合蛋白的形式进行表达，该系统尤其适合表达对细胞有毒害的蛋白。

【器材与试剂】

1. 37℃摇床，移液枪，超净台，分光光度计

2. LB培养基，100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷：2.38g IPTG溶于100ml超纯水中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存备用。

实验原理介绍

20min

讲授10 min

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

【实验方法与步骤】 

1、 将挑选含有重组质粒的克隆至5ml LB液体培养基中，含卡纳抗生素50μg/ml, 37℃摇床过夜培养。

2、 按照1:50比例稀释过夜培养菌到含有50ml培养基的300ml培养瓶中，37℃震荡培养OD600为0.4-0.6，时间大约3h。

3、 取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养3h。

4、 分别取菌体1ml，离心12000g  30s收获沉淀，用100μL 1%SDS重悬，混匀，70℃ 10min。

5、 12000g离心1min，取上清作为样品，留作SDS-PAGE电泳分析。

实验操作

小结

重组载体原核诱导表达注意事项和实验原理

简要板书

1. IPTG使用浓度和诱导原理

2. OD600吸光度检测

步骤重点介绍

 20min

操作

60min

小结

10min