课程

分子生物学

实验技术

题目

实验7 转化

学时

讲授

实验

3

练习

行课时间

2015年6月2日 第1-3节

课次

第7次

教 材

生物化学与分子生物学实验，科学出版社，杨建雄

教 具

ppt

教 学

目 的

要 求

1、掌握CaCl2的热激法原理

2、熟悉转化的实验技术与方法

3、了解转化效率影响因素

教学重点

难点及其

解决方案

教学重点: CaCl2的化学转化法原理

教学难点: 转化的实验技术与方法

解决方案：通过细化实验指导，教师带教实验操作

参 考

资 料

1. 魏群 主编，分子生物学实验指导，高等教育出版社，2010年

2. 郑伟娟 主编，现代分子生物学实验，高等教育出版社，2008年

3. 李钧敏 主编，分子生物学实验，浙江大学出版社，2009年

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

【实验方法】：

实验包括阳性和阴性对照

1、用冷却的无菌吸头从每份用CaCl2溶液制备的感受态悬液中西区200ul转移到无菌离心管（17*100mm）中，每管加入DNA（用不超过10ul的体积，其中的DNA小于50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。

2、将管放入预加热至42℃的循环水浴中，恰恰放置90s，不要摇动管。

热激是一个关键步骤，准确地达到热敷温度非常重要。

3、快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。

4、每管加800ulSOC培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到摇床上，温育45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

复苏期中应于37℃温和地摇动细胞（用低于50r/min转速的摇床）。

5、将适当体积（每个90mm平板达200ul）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4

和相应抗生素的SOB琼脂培养基上。

重要：玻璃铺菌器需先在乙醇在浸泡，然后在酒精灯上灼烧，待它凉至室温后，才可将转化菌轻轻地铺在琼脂板上。

如检查氨苄青霉素的抗性，用转化菌铺平板时密度应较低（每个90mm平板不超过104菌落），于37℃培养的时间按不超过20h。氨苄青霉素抗性的转化体可将β-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域的青霉素。这样，铺平板时密度过高或培养时间按过长都会导致出血对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60ug/ml提高到100mg/ml,可使情况有所改善，但不能产地根除之。抗氨苄青霉素的增加与平皿上所加的细菌数的增加并无线形比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞释放生长抑制物质的缘故。

6、将平板置于室温直至液体被吸收。

7、倒置平皿，于37℃培养，12-16h后可出现菌落。

讲授15min

教师带教操作

30min

提出问题学生解答

10min

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

转化效率：

为确定感受态细胞的转化效率，可将一定量的完整质粒转化到感受态细胞中，取一部分转化的细菌，涂布到选择培养基上，可用菌落生长单位/μg DNA，按下面的方法计算感受态细胞的转化效率.

计算公式：转化效率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量。

取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞. 向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板.培养过夜，产生1000个菌落。转化0.1 ng DNA，用SOC稀释到1000μl后，取1/10涂平板，则涂平板共用0.01 ng DNA 质粒，所以转化率＝1000克隆/0.01 ng DNA =105 cfu/ng=108 cfu/μg

【实验操作】

小结

简要板书

1. 感受态细胞的状态分析

2. 转化的实验注意事项

实验操作60min

5min