成 都 医 学 院 教 案 首 页
2013 级 生物制药 本科班 任课教师： 郝军莉
| 课程
|
分子生物学
实验技术
|
题目
|
PCR基因扩增和琼脂糖凝胶电泳
|
学时
|
讲授
|
|
| 实验
|
3
|
| 练习
|
|
| 行课时间
|
2015年5月12日 第1-3节
|
课次
|
第4次
|
| 教 材
|
生物化学与分子生物学实验，科学出版社，杨建雄
|
| 教 具
|
ppt
|
| 教 学
目 的
要 求
|
1、掌握PCR和琼脂糖凝胶电泳实验原理、方法和试剂作用
2、熟悉PCR仪器的操作；熟悉琼脂糖凝胶制胶、上样
3、了解其他PCR及电泳的实验方法
|
| 教学重点
难点及其
解决方案
|
教学重点: PCR和琼脂糖凝胶电泳实验原理、方法和试剂作用
教学难点: PCR实验原理和琼脂糖凝胶制胶、上样
解决方案：PCR Flash操作演示,PCR仪和琼脂糖电泳操作演示
|
| 参 考
资 料
|
1. 魏群 主编，分子生物学实验指导，高等教育出版社，2010年
2. 郑伟娟 主编，现代分子生物学实验，高等教育出版社，2008年
3. 李钧敏 主编，分子生物学实验，浙江大学出版社，2009年
|
| 实 施
情 况
小 结
|
|
教研室主任签名： 年 月 日
成 都 医 学 院 教 案 续 页
| 教学过程、内容及时间分配
|
教学方法与手段
|
| 【PCR、琼脂糖凝胶电泳实验定义】
PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。
琼脂糖凝胶具有网络结构，蛋白质和核酸根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。
【PCR、琼脂糖凝胶电泳实验原理】
模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成
蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
【PCR引物反应体系】
1．引物
引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。
2．酶及其浓度
Taq DNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离的。典型的PCR反应约需的酶量为2.5u，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
3．dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
4．模板（靶基因）核酸
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
5．Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/l为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
|
讲授15min
重点介绍
Flash播放20min
重点讲授
讲授10min
|
成 都 医 学 院 教 案 续 页
| 教学过程、内容及时间分配
|
教学方法与手段
|
| 【琼脂糖凝胶电泳反应体系】
（一）准备干净的配胶板和电泳槽
注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA。
（二）选择电泳方法
一般的核酸检测琼脂糖凝胶电泳就可以；需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。
（三）正确选择凝胶浓度
对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。
（四）适合的电泳缓冲液
常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
【PCR引物反应步骤】
l 试剂配置体积：
20μl体系中各试剂配置如下表：
| 试剂
|
H2O
|
Buffer
|
Mg2+
|
dNTPs
|
P（引物）
|
T（模板）
|
E（酶）
|
| 体积/μl
|
9
|
2
|
2
|
4
|
2
|
1
|
0.4
|
l 程序
预变性94℃，5-10min；变性94℃，45-60s；退火：50-65℃，30s。退火温度计算：Tm（解链温度）=4（G+C）+2（A+T）；延伸：72℃，1-1.5min。步骤变性-延伸热循环25-30个周期；保温：延伸72℃，10min。
【琼脂糖凝胶电泳反应步骤】
配制1%的胶进行电泳
1、 称取0.4g琼脂糖放于锥形瓶中，量取40ml的0.5×TBE溶液混合，放于微波炉中煮沸，至溶液清彻透明为止。
2、 冷却到60℃时（放于掌心，能感觉到汤但又能忍受），加2μl核酸染料，摇匀。
3、 组装好制胶器，并调至水平。将胶倒于制胶器中，插好梳子。待40分钟胶冷却凝固后，就可放于倒好电泳缓冲液的电泳槽中进行点样。
4、 取5-10μl样品溶液，加1-2μl 6×loading Dye，混合均匀后进行点样。每排点样孔要点一个5μl的Marker。
5、 点完后，调电泳仪各参数进行电泳：U：80V；A；200A；T：40min。
小结
1. PCR、琼脂糖凝胶电泳实验的主要原理
2. PCR实验的主要试剂及作用
|
讲授10min
60min
5min
|
