课程

分子生物学

实验技术

题目

RNA提取

学时

讲授

实验

3

练习

行课时间

2015年5月5日 第1-3节

课次

第3次

教 材

生物化学与分子生物学实验，科学出版社，杨建雄,2008

教 具

ppt

教 学

目 的

要 求

1、掌握动物组织和细胞中总RNA的提取和反转录为cDNA的方法和原理

2、熟悉RNA提取、反转录成cDNA所用试剂成分和作用

3、了解RNA与DNA提取的不同和区别

教学重点

难点及其

解决方案

教学重点: 动物组织RNA提取和反转录cDNA的方法和原理

教学难点: RNA提取、反转录成cDNA所用的试剂成分和作用

解决方案：RNA提取、反转录成cDNA所用试剂成分和作用详细讲解

参 考

资 料

1. 魏群 主编，分子生物学实验指导，高等教育出版社，2010年

2. 郑伟娟 主编，现代分子生物学实验，高等教育出版社，2008年

3. 李钧敏 主编，分子生物学实验，浙江大学出版社，2009年

实 施

情 况

小 结

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

组织RNA提取、反转录成cDNA的实验原理

【实验目的】
（1）学习并掌握动物组织总RNA的提取方法及其原理；掌握RNA反转录

为cDNA的方法和原理。
（2）从肝脏组织中提取到一定量的纯净的RNA样品并建立cDNA文库。
【实验原理】
RNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞质中。通过液氮研磨动物肝脏，加入Trizol破碎细胞，抑制RNAase活性；氯仿可使蛋白质变性，离心除去DNA和变性蛋白质，RNA位于上层水相中；异丙醇沉淀RNA，溶于DEPC水中，在反转录酶、底物等的作用下，RNA反转录为cDNA。

【仪器、材料、试剂】
（一）仪器
高速离心机、烘箱、冰箱、微量移液器、高压灭菌锅、核酸分析仪、PCR仪
（二）材料
DEPC、Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、75%乙醇、DEPC水、手术剪刀、镊子、吸水纸、微量取液器、研钵、液氮、1.5mL 离心管、200ul PCR管、Takara反转录试剂盒、一次性手套、口罩、1.5mL离心管架、记号笔

（三）试剂配制
1．75%乙醇：DEPC水稀释无水乙醇

2、DEPC水：去离子水中加入0.1%DEPC水处理24 h，高压灭菌 
【实验步骤】

1、 细胞中加入1 ml Trizol颠倒混匀，室温放置5min，使其充分裂解。4℃ 12,000g离心5min，去除沉淀。（注意：此时可放入-70℃长期保持。 ）

2、 按200 ul 氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置2-3 min。 

   (注意：此步一定要振荡混匀，使氯仿和Trizol不分层。)

3、 上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60％。（此步开始组长负责组织各组同步进行离心）

4、 吸取上层水相，至另一新的离心管中。一般400-450 ul 就足够了，千万不要贪多！  （注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相。）

讲授5min

重点介绍40min

讲授10min

教学过程、内容及时间分配

教学方法与手段

5、 加入等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，室温放置10 min。 

6、 4℃ 12,000g离心10 min，弃上清，离心后在管侧和管底出现白色沉淀。

7、 加入1 ml 75%乙醇，（切勿触及沉淀！）上下颠倒，温和振荡离心管。 

8、 4℃ 12,000g离心5 min，尽量弃上清。 

9、 室温晾干或真空干燥5 min。（注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。）

10、加入50 ul无RNase的DEPC水，充分混匀。

11、按照Takara反转录试剂盒说明书，加入dNTP Mix (2.5mM Each)               4ml；Primer Mix 2 ml；5×RT Buffer 4 ml；RNAase inhibitor 2 ml；HiFi-MMLV (200U/ml) 1 ml；DEPC水 4ml；Total RNA 3ml；共20ml体系。                                                                                

12、充分混匀，反转录步骤在PCR仪中进行：42℃ 50min（反转录反

应），70℃ 15min （反转录酶失活反应）， 4℃   ∞ ，cDNA保存于-20℃备用

【实验操作】

【注意事项】
1．抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对RNA的损伤。
2．取上层清液时，注意不要吸起中间的DNA和有机相。
3．75%乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起RNA。
4．离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。

小结：RNA提取的注意事项和实验原理

简要板书

1. 动物组织RNA的提取、cDNA文库建立的实验原理

2. RNA提取方法

3. RNA提取试剂主要成分和作用

4. cDNA文库建立的原理

操作60min

讲授5min